黃柏等中草藥對MRSA的抑菌作用及其對質(zhì)粒的消除作用

陳 晴，謝鯤鵬，云寶儀，霍洪楠，謝明杰

(遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遼寧省生物技術(shù)與分子藥物研發(fā)重點實驗室，遼寧大連 116081)

隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌對抗生素的耐藥已成為臨床上的嚴(yán)重問題。其中具有多重耐藥性的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureaus，MRSA)，由于其耐藥水平越來越高，給人類和動植物的健康帶來了極大危害［1-2］。目前關(guān)于細(xì)菌產(chǎn)生耐藥的原因主要包括以下幾方面:一是與基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)的耐藥和主動外排系統(tǒng);二是由染色體或耐藥質(zhì)粒-R質(zhì)粒介導(dǎo)，在不同菌株之間進(jìn)行傳遞，使敏感菌成為耐藥菌［3］。由于質(zhì)粒可在不同菌株間轉(zhuǎn)移和傳播，因此有關(guān)耐藥質(zhì)粒的研究受到廣泛關(guān)注［4-5］。一些學(xué)者希望通過消除耐藥性質(zhì)粒來解決細(xì)菌的耐藥性問題，目前高溫培養(yǎng)、紫外線照射和用SDS、溴化乙啶等人工方法均能消除R質(zhì)粒［6-9］。但由于上述物理方法很難在臨床上應(yīng)用，而化學(xué)藥劑對人體又有較強(qiáng)的毒副作用，因此選擇高效安全無毒的質(zhì)粒消除劑成為目前的研究熱點。中草藥屬于天然植物藥，毒副作用小，應(yīng)用安全。有研究報道，中草藥除具有抑菌作用外，還對R質(zhì)粒有消除作用［10-13］，因此從中草藥中篩選質(zhì)粒消除劑是解決細(xì)菌耐藥性的途徑之一。本文研究了黃柏等10種中草藥對MRSA的抑菌作用及黃柏和甘草對MRSA的質(zhì)粒消除作用，為中草藥治療由質(zhì)粒引起的疾病和解決由質(zhì)粒介導(dǎo)的細(xì)菌耐藥性傳播問題提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)，由吉林大學(xué)附屬醫(yī)院菌種保藏中心提供。

1.1.2 中草藥 黃柏、甘草、柴胡、地榆、石榴皮、艾葉、牡丹皮、吳茱萸、馬齒莧、金銀花10種中草藥由遼寧師范大學(xué)中藥現(xiàn)代化實驗室提供。

1.1.3 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl 5，瓊脂15 ～20，水1 L，pH 7.4 ～7.6。

1.2 方法

1.2.1 MRSA菌懸液的制備 將活化培養(yǎng)后的MRSA接種于LB液體培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)至對數(shù)期，調(diào)整菌液的濃度為 106～107cfu/mL，備用。

1.2.2 黃柏等10種中草藥粗提物的制備 稱取一定量的黃柏、甘草等中草藥，分別用95%的乙醇熱回流提取8 h后，將提取液蒸干制成干粉。用無水乙醇分別配制成濃度為100 mg/mL的藥液，備用。

1.2.3 中草藥的抑菌活性實驗［14］采用牛津杯法檢測10種中草藥對MRSA的抑菌作用。在培養(yǎng)皿中倒入牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，待凝固后均勻地涂布MRSA菌懸液，然后用無菌鑷子等距離分散地輕輕放上無菌牛津杯(內(nèi)徑6 mm，外徑8 mm，高10 mm)，靜置5 min后，在杯內(nèi)分別注入200 μL濃度為25 mg/mL的不同中草藥提取物，用無水乙醇作為對照，每組做3個平行實驗。37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后，用直尺測量各種中藥的抑菌圈直徑，取其平均值。

1.2.4 不同濃度的中草藥提取物抑菌作用的測定 取濃度為100 mg/mL的藥液，按2倍稀釋法依次稀釋為 50、25、12.5、6.25 和 3.13 mg/mL 5個不同濃度梯度，按照1.2.3的方法，測定不同濃度中草藥提取物的抗菌作用，每組做3個平行實驗。

1.2.5 中草藥對MRSA最低抑菌濃度(MIC)的測定 將MRSA菌培養(yǎng)至對數(shù)期，調(diào)整菌液的濃度為106～107cfu/mL，在96孔板中分別加入150 μL菌懸液和15 μL不同濃度的供試藥液，使藥液的終濃度分別為 2、1、0.5、0.25 和 0.125 mg/mL，在37℃下100 r/min搖床中培養(yǎng)24 h，然后每孔分別加入 15 μL 濃度為 0.2%2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)，37℃ 100 r/min下避光培養(yǎng)4 h后，觀察其顏色變化，以無水乙醇為空白對照。

1.2.6 抗生素對MRSA的MIC測定方法 取慶大霉素(Gm)和紅霉素(Em)2種抗生素，按照2倍稀釋法，配制成不同濃度梯度，其中終濃度分別為 128、256、512 和 1 024 μg/mL，操作方法同1.2.5。

1.2.7 中草藥對MRSA的質(zhì)粒消除實驗 ①在培養(yǎng)至對數(shù)期的MRSA菌懸液中加入一定濃度的中草藥過夜培養(yǎng)，然后分別涂布在LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24 h，選取菌落數(shù)在200～300個左右的平板，采用逐個檢出法分別接種在含有慶大霉素和紅霉素的選擇培養(yǎng)基上和普通培養(yǎng)基平板上。37℃下培養(yǎng)至24 h和48 h，觀察平板上的菌落數(shù)量并記錄結(jié)果。以不加藥液的培養(yǎng)基作空白對照，以SDS作為陽性對照組，每組重復(fù)3次，取其平均值;②抗生素選擇培養(yǎng)基的制備:在LB培養(yǎng)基中分別加入1/2 MIC的慶大霉素和紅霉素，配制成篩選質(zhì)粒消除的選擇性培養(yǎng)基，現(xiàn)用現(xiàn)配;③質(zhì)粒消除的結(jié)果判定［5］:在不含抗生素的平板上生長而在含抗生素的選擇平板上不生長，即為質(zhì)粒消除子(需在選擇培養(yǎng)基平板上進(jìn)行復(fù)試確認(rèn))。

A:在不含抗生素的普通培養(yǎng)基平板上生長而在含抗生素的選擇性培養(yǎng)基平板上不生長的菌落數(shù);B:在不含抗生素的普通培養(yǎng)基平板上生長的菌落數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 不同中草藥提取物的抑菌作用結(jié)果

實驗結(jié)果顯示，10種中草藥提取物對MRSA均有抑制作用，其中黃柏和甘草對MRSA的抑制效果最好，抑菌圈直徑分別為24 mm和22 mm，故選用黃柏和甘草進(jìn)行進(jìn)一步的研究(表1)。

表1 10種中草藥提取液的抑菌作用結(jié)果Table 1 The bacteriostasis of 10 kinds of Chinese herbal medicine extracting solution

2.2 不同濃度的黃柏和甘草提取物對MRSA的抑制作用結(jié)果

實驗結(jié)果顯示，黃柏和甘草對MRSA的抑制作用，在一定濃度范圍內(nèi)隨藥物濃度的增大而增強(qiáng)，呈劑量依賴性(表2)。

表2 不同濃度的黃柏和甘草提取物對MRSA的抑制作用Table 2 Inhibitory effect of different concentrations of cortex phellodendri and radix glycyrrhizae extract on MRSA

2.3 黃柏和甘草提取物對MRSA的MIC測定結(jié)果

TTC是一種常用的活菌染料，氧化態(tài)為無色，該染料進(jìn)入細(xì)胞后TTC能夠與活細(xì)胞內(nèi)的琥珀酸脫氫酶反應(yīng)，生成紅色的還原產(chǎn)物甲臜并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。實驗結(jié)果顯示(表3)，經(jīng)TTC染色后，培養(yǎng)基的顏色隨黃柏和甘草濃度的增加而變淺，直至無色。當(dāng)黃柏和甘草的濃度大于1 mg/mL時，可完全抑制MRSA的生長，故黃柏和甘草對MRSA的MIC均為1 mg/mL。

表3 黃柏和甘草對MRSA的MIC測定結(jié)果Table 3 The MIC of cortex phellodendri and radix glycyrrhizae on MRSA

2.42 種抗生素對MRSA的MIC測定結(jié)果

2種抗生素對MRSA的MIC測定結(jié)果見表4。由表4可知，本實驗所用的MRSA菌株為多重耐藥菌株，其對于慶大霉素和紅霉素的MIC值均大于1 000，該結(jié)果用于質(zhì)粒消除實驗中抗生素選擇性培養(yǎng)基的制備。

表4 2種抗生素對MRSA的MIC值Table 4 The MIC of two kinds of antibiotics on MRSA

2.5 黃柏和甘草對MRSA的質(zhì)粒消除實驗結(jié)果

黃柏和甘草對MRSA的質(zhì)粒消除實驗結(jié)果見表5、表6。由表可知，黃柏和甘草對MRSA質(zhì)粒有一定的消除作用，且消除效果隨時間的延長而增強(qiáng)。當(dāng)黃柏和甘草作用 MRSA 48 h時，其質(zhì)粒消除率分別為27.8%和13.6%。

表5 黃柏和甘草作用24 h對MRSA質(zhì)粒的消除率Table 5 The plasmid elimination rates of cortex phellodendri and radix glycyrrhizae on MRSA for 24 h

表6 黃柏和甘草作用48 h對MRSA質(zhì)粒的消除率Table 6 The plasmid elimination rates of cortex phellodendri and radix glycyrrhizae on MRSA for 48 h

3 討論

耐藥性指微生物對藥物所具有的相對抗性。細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的原因很多，在基因水平上，主要有染色體基因的突變引起的耐藥性和R質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥性。隨著MRSA感染的日益增多，人們越來越重視對于MRSA耐藥性的消除研究。質(zhì)粒是染色體外具有獨(dú)立復(fù)制能力的對細(xì)菌生存非必需的小型共價閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子，在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)普遍存在。某些質(zhì)粒可自然丟失，但用物理或化學(xué)方法處理，可使子代細(xì)菌中的質(zhì)粒消除率比自然丟失增加102～105倍，且質(zhì)粒消除后其控制的特性不再恢復(fù)，除非外源質(zhì)粒轉(zhuǎn)入［15-17］。有研究結(jié)果顯示，中草藥具有消除質(zhì)粒的作用，且具有質(zhì)粒消除作用的中草藥大都以具有清熱解毒或抗菌功能為主，如鞠洪濤等［18］研究結(jié)果顯示，艾葉、大蒜油、魚腥草和紫草對大腸埃希菌質(zhì)粒具有消除作用。本研究結(jié)果表明，黃柏等10種中草藥對MRSA有較強(qiáng)的抑制作用，且抑制作用在一定濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性。其中黃柏和甘草的抑菌效果最為明顯，MIC均為1.0 mg/mL。對這2種藥物的質(zhì)粒消除實驗結(jié)果表明，黃柏和甘草對MRSA質(zhì)粒有一定的消除作用，且消除率隨時間的延長而增強(qiáng)。但其消除率還不是很高，因此從中草藥中繼續(xù)篩選質(zhì)粒消除劑和如何提高其質(zhì)粒消除率尚需進(jìn)一步的研究。

［1］ 潘宏升，田素飛，年華，等.耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的分子流行病學(xué)研究［J］.微生物學(xué)雜志，2011，31(1):34-38

［2］ 楊杰，饒賢才.耐藥機(jī)制指導(dǎo)下的抗金葡菌藥物開發(fā)現(xiàn)狀［J］.微生物學(xué)雜志，2007，27(3):83-86.

［3］ 董方，徐樨巍，宋文琪.臨床分離大腸埃希菌和克雷伯菌質(zhì)粒介導(dǎo)AmpCβ內(nèi)酰胺酶的研究［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2010，90(38):2723-2725.

［4］ 韓偉，張鐵，鐘秀會.大腸桿菌的耐藥機(jī)制及中藥對大腸桿菌R質(zhì)粒消除作用的研究［J］.中獸醫(yī)醫(yī)學(xué)雜志，2006，(3):25-27.

［5］ 劉平，葉惠芬.5種中藥對產(chǎn)酶菌的抑菌作用［J］.中國微生態(tài)學(xué)雜志，2006，18(1):39-40.

［6］ 王小平.松蘿酸對金黃色葡萄球菌耐藥質(zhì)粒的消除作用［J］.中藥材，2006，29(1):36-39.

［7］ 龍海英，劉衡川，方梅.質(zhì)粒消除方法及消除效果的評價研究［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2007，17(3):413-415

［8］ 李萇清，周岐新，凌保東.耐藥質(zhì)粒消除的研究概況與展望［J］.北京醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2003，18(2):168-171.

［9］ 鐘義軍，吳曉玉，劉好桔，等.洋蔥伯克霍爾德菌T1828質(zhì)粒消除方法及條件［J］.微生物學(xué)通報，2011，38(6):847-852.

［10］項褡財.R質(zhì)粒的紫外線消除試驗改進(jìn)和體會［J］.皖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2001，20(2):154.

［11］張寅晨，吳雨龍.中藥連翹對大腸桿菌R質(zhì)粒消除作用的研究［J］.安徽農(nóng)學(xué)通報，2009，15(13):57-58.

［12］彭元麗，鄒坤，陳國華.中藥消除大腸桿菌耐藥質(zhì)粒研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2009，20(1):139-140.

［13］王興旺，胡勇.蒼術(shù)對大腸桿菌耐藥質(zhì)粒消除作用的研究［J］.重慶工學(xué)院學(xué)報，2006，20(2):123-125.

［14］馬緒榮，蘇德模.藥品微生物學(xué)檢驗手冊［M］.北京:科學(xué)出版社，2001，210-220.

［15］盛祖嘉.微生物遺傳學(xué)［M］.北京:科學(xué)出版社，2007:208-214.

［16］賈文祥.醫(yī)學(xué)微生物學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2010:108-112.

［17］李萇清，周岐新，凌保東.耐藥質(zhì)粒消除的研究概況與展望［J］.川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2003，18(2):168-171.

［18］鞠洪濤，韓文瑜，王世若，等.大腸桿菌耐藥基因定位及耐藥質(zhì)粒消除［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報，2000，20(6):561-564.