羧甲基茯苓多糖脂質體的制備及其包封率的測定

2013-09-13 11:02:38趙永新趙子劍

中國醫藥導報 2013年3期

趙永新趙子劍王鄒

懷化學院，湖南懷化 418000

羧甲基茯苓多糖（CMP）系多孔菌真菌茯苓中β-茯苓聚糖的衍生物，具有增強免疫、抗腫瘤、抗病毒、抗放射、保肝、抗衰老、鎮靜等作用，目前臨床上已應用的劑型主要有口服液、膠囊、片劑等。CMP 在人體內的半衰期比較短，因此作為一種具有免疫調節作用的抗腫瘤輔助藥物，在臨床上的應用受到明顯的限制。筆者將羧甲基茯苓多糖制備成脂質體，旨在利用脂質具有靶向性和淋巴定向性、緩釋性、細胞親和性與組織相容性、降低藥物毒性、保護藥物提高穩定性等特點，從而改變藥物在體內的分布，延緩藥物在體內的釋放，降低藥物的毒性[1-5]。羧甲基茯苓多糖脂質體的不斷發展，可以為臨床抗腫瘤治療提供更加方便、有效的新劑型，具有巨大的市場潛力，可以創造良好的社會效益和經濟效益。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

旋轉蒸發儀（鄭州長城科工貿有限公司），SHZ-D（Ⅲ）循環水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司），燒瓶，容量瓶，恒溫水浴鍋（鄭州長城科工貿有限公司），DW-2型多功能電動攪拌機（鞏義市予華儀器有限責任公司），紫外分光光度儀（日本島津制造UV-2450），800 型電動離心機（江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠），電子天平，燒瓶，容量瓶。

2.2 試藥

羧甲基茯苓多糖，大豆卵磷脂（江蘇曼氏生物科技有限公司），膽固醇（南京新百藥業有限公司），無水乙醚（分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司），磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉。

2 方法與結果

2.1 實驗制備方法

2.1.1 實驗處方

本組研究中，一共選擇6 種不同的處方作為研究對象：①將1.5g 大豆磷脂、0.5g 膽固醇以及10 mL 無水乙醚加入到1 mg/L的CMP 溶液50 mL 中，制成50 mL的脂質體。②將1.5g 大豆磷脂、0.5g 膽固醇以及10 mL 無水乙醚加入到10 mg/L的CMP 溶液50 mL 中，制成50 mL的脂質體。③將1.5g 大豆磷脂、0.5g 膽固醇以及10 mL 無水乙醚加入到20 mg/L的CMP 溶液50 mL 中，制成50 mL的脂質體。④將1.5g 大豆磷脂、0.5g 膽固醇以及10 mL 無水乙醚加入到50 mg/L的CMP 溶液50 mL 中，制成50 mL的脂質體。⑤將1.5g 大豆磷脂、0.5g 膽固醇以及10 mL 無水乙醚加入到100 mg/L的CMP 溶液50 mL 中，制成50 mL的脂質體。⑥將1.5g 大豆磷脂、0.5g 膽固醇以及10 mL 無水乙醚加入到50 mL 磷酸鹽（PBS）緩沖液中，制成50 mL的脂質體。

2.1.2 磷酸鹽緩沖液（PBS）的制備

稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4）5.59 g 與磷酸二氫鈉（NaH2PO4）0.41 g，加蒸餾水適量，溶解并稀釋至 1 000 mL（pH 約為 7.8），搖勻[6]。

2.1.3 空白脂質體的制備

2.1.3.1 稱取處方量磷脂，膽固醇，至于100 mL 燒瓶中，加無水乙醚10 mL，55℃水浴中，攪拌使溶解，于旋轉蒸發儀上旋轉，使磷脂的乙醚在壁上成膜，除去乙醚，制備磷脂膜[7]。

2.1.3.2 另取磷酸緩沖液50 mL 至于小燒杯內，同置于55℃水浴中，保溫，待用[8]。

2.1.3.3 取預熱的磷酸鹽緩沖液50 mL，加至含有磷脂膜的燒瓶中，轉動下，55℃水浴中水化10～20 min。取出脂質體液體于燒杯內，置于磁力攪拌器上，室溫，攪拌30～60 min，混勻，即得[9]。

2.1.4 含藥脂質體的制備

2.1.4.1 稱取適量的羧甲基茯苓多糖，用磷酸緩沖液分別配成 1、10、20、50、100 mg/mL 的 5種濃度的溶液來配制羧甲基茯苓多糖溶液。

2.1.4.2 稱取處方量磷脂，膽固醇，至于100 mL 燒瓶中，加無水乙醚10 mL，55℃水浴中，攪拌使溶解，于旋轉蒸發儀上旋轉，使磷脂的乙醚在壁上成膜，除去乙醚，制備磷脂膜。

2.1.4.3 另取羧甲基茯苓多糖溶液50 mL（1 mg/mL）置于小燒杯內，同置于55℃水浴中，保溫，待用。

2.1.4.4 取預熱的液羧甲基茯苓多糖溶液50 mL，加至含有磷脂膜的燒瓶中，轉動下，55℃水浴中水化10～20 min。取出脂質體液體于燒杯內，置于電動攪拌器上，室溫，攪拌30～60 min，混勻，即得。

2.1.4.5 按照上面的方法依次制備濃度為10、20、50、100 mg/mL的羧甲基茯苓多糖溶液的脂質體。

2.2 羧甲基茯苓多糖脂質體含量測定的方法

2.2.1 羧甲基茯苓多糖溶液的配制

精確稱取羧甲基茯苓多糖0.1 g，加入到100 mL的量瓶中，加二次蒸餾水至刻度，定容搖勻，配制成1 g/L的羧甲基茯苓多糖溶液，待用。

2.2.2 測定波長的選擇

用移液管吸取5mL的1 g/L的CMP 溶液于50 mL的容量瓶中配制成100 mg/L的CMP 溶液。精密量取該溶液2 mL，置20 mL 具塞試管中，分別加入80%的苯酚溶液50 μL 以及濃硫酸 5mL，搖勻，靜置 10 min，置于 25～30℃的水浴中保溫20 min。以2 mL 二次蒸餾水代替CMP 溶液，同法所得為空白溶液。繪制450～250 nm的吸收曲線。CMP的最大吸收波長為298 nm。

2.2.3 標準曲線的制備

精密稱取CMP 10 mg 于100 mL 容量瓶中，用二次蒸餾水定容至100 mL，振搖得濃儲備液。精密量取濃儲備液適量于50 mL的容量瓶中，加二次蒸餾水定容至刻度，制備濃度分別為 1、10、20、50、100 mg/L 的溶液，以二次蒸餾水為空白溶液，于298 nm 波長處測定吸收度。

2.3 羧甲基茯苓多糖脂質體包封率的測定

量取羧甲基茯苓多糖脂質體溶液2 mL，加pH 7.8的PBS 緩沖液2 mL 混勻，待脂質體凝聚，然后于電動離心機（2 000 r/min）上離心30 min，將上清液定量稀釋；另外量取羧甲基茯苓多糖脂質體溶液2 mL，加入無水乙醚2 mL 破壞脂質體后，用PBS 定量稀釋，然后于掃描到的紫外吸收

的最大吸收峰所對應的波長處測定上清液和總藥的吸收度，帶入標準曲線，計算羧甲基茯苓多糖的濃度，按下式計算藥物的包封率：包封率=（C總-C上清/C總）×100%，其中，C上清為上清液中所測得藥物濃度，C總為羧甲基茯苓多糖脂質體測得的藥物濃度[10]。

2.4 結果

2.4.1 含量測定方法學考察

2.4.1.1 紫外掃描結果表明，在298 nm 波長處羧甲基茯苓多糖有最大吸收，見圖1。

2.4.1.2 以CMP的吸收度A 對CMP的濃度C 進行線性回歸，得線性方程為：A=0.006 7C+2.694，r=0.992 0，羧甲基茯苓多糖在1～100 mg/L 濃度范圍內吸光度（A）與濃度（C）線性良好。羧甲基茯苓多糖在濃度為 1、10、20、50、100 mg/L 時，吸光度分別為 2.74、2.765、2.78、2.99、3.39，見圖2。

2.4.2 羧甲基茯苓多糖脂質體包封率的測定

不同濃度的羧甲基茯苓多糖脂質體有不同的包封率，在1～50 mg/L 之間包封率明顯增加，而在50～100 mg/L 之間則有所下降，并且在50 mg/L 處包封率值最大。見表1。

3 討論

羧甲基茯苓多糖為水溶性物質，因脂質體對水溶性藥物的包封率較低，適合水溶性藥物脂質體的制備方法為逆向蒸發法[11]。但由于受實驗條件的影響，本文中羧甲基茯苓多糖脂質體的制備采用薄膜分散法制備，旨在尋找適合制備羧甲基茯苓多糖脂質體的最佳藥物濃度，并且采用離心分離法測定脂質體的包封率[12]。而在脂質體的質量評價中則需要考察：形態與粒徑及其分布，包封率，滲漏率，磷脂的氧化程度，氧化指數的測定，有機溶劑殘留量等是否符合要求[13]。受實驗條件的限制，本文只做了脂質體包封率的測定，如果在條件允許的情況下，則應該對上述幾點做一個全面的檢測[14-15]。此外，還可以單獨就影響包封率的因素方面進行展開，探討最佳的制備工藝：磷脂的最佳配比（合適的配比可以提高脂質體的穩定性和包封率），最佳的反應溫度（溫度影響在脂質體的穩定性和包封率），最佳的油水比（油水比過小時，不能很好的形成較穩定的油包水形乳液；油水比過高時，則脂質體中包封的水溶性藥物絕對量太少）等一系列工藝[16-17]。