滇大薊中黃酮的提取及其對羥基自由基清除作用研究

管春平，何艷嬌，徐成東

(楚雄師范學院化學與生命科學系，云南 楚雄 675000)

黃酮類化合物 (flavones compounds)泛指兩個苯環 (A與B)通過三個碳原子相互聯結而成的一系列化合物［1］，主要包括黃酮、黃酮醇、異黃酮、二氫黃酮、查耳酮等，廣泛存在蔬菜、水果、牧草、漿果和藥用植物中，大約有4千多種。黃酮類化合物具有廣泛的生物活性，可以改善血液循環、降低膽固醇、抑制炎性生物酶的滲出、增進傷口愈合和止痛，它還具有很強的抗氧化活性，可有效清除體內的氧自由基［2］。

滇大薊［3］(Cirsium chlorolepis Petrak)，菊科薊屬多年生草本野生藥用植物，在滇中大部分地區有分布，生長于山坡或田野溝邊、路旁。滇大薊的營養及藥用價值極高，可作蔬菜煮食，具清涼、消炎作用;入藥能涼血、止血、散瘀、治吐血、咯血等癥，主要含有黃酮和黃酮苷，三萜類、甾體類、揮發油類等化學成分［4］。滇大薊在云南代替大薊入藥［5］，從中提取黃酮還尚未見相關研究報道。探究滇大薊中黃酮的提取條件及提取液對羥基自由基的清除作用，有利于滇大薊資源的開發，為今后滇大薊的利用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑、儀器

1.1.1 材料

滇大薊，采于云南石林縣，經楚雄師范學院徐成東教授鑒定為菊科薊屬植物滇大薊。

1.1.2 試劑

無水乙醇、蘆丁標準品、水楊酸、氫氧化鈉、鋅粉、亞硝酸鈉、硫酸亞鐵、硝酸鋁、雙氧水、濃氨水、三氯化鐵、鹽酸、BHT(二丁基羥基甲苯)，以上試劑為分析純;蒸餾水。

準確稱取干燥恒重蘆丁10mg，加適量70%乙醇溶解并轉移至50mL容量瓶中，定容，搖勻，得濃度為0.2mg/mL的蘆丁標準溶液。

1.1.3 儀器

722S型光柵分光光度計 (山東高密分析儀器廠)、CP214C電子天平 (奧豪斯儀器有限公司)、HH—S2S恒溫水浴鍋 (金壇市大地自動化儀器廠)、DFY－500型搖擺式高速中藥粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料處理

滇大薊洗凈→曬干→粉碎→備用。

1.2.2 黃酮類化合物的提取

稱取4.0g滇大薊粉末，置于圓底燒瓶中，加入50.0mL70%乙醇溶液，裝上冷凝裝置，在70℃下恒溫水浴2h，過濾，制得提取液。

1.2.3 提取液的定性檢驗［6］

鋁鹽反應:取提取液1.0mL于試管中，加入幾滴1%硝酸鋁溶液，振蕩。若溶液顏色顯黃色，則說明提取液中含有黃酮。

濃氨水反應:取提取液1.0mL于試管中，加入幾滴濃氨水溶液，振蕩。若溶液顯亮黃色，則說明提取液中含有黃酮。

氫氧化鈉反應:取提取液1.0mL于試管中，加入幾滴4%氫氧化鈉溶液，振蕩。若溶液顯亮黃色，則說明提取液中含有黃酮。

乙酸鉛反應:取提取液1.0mL于試管中，加入幾滴乙酸鉛溶液，振蕩。若有黃色沉淀產生，則說明提取液中含有黃酮。

濃硫酸反應:取提取液1.0mL于試管中，加入幾滴濃硫酸，振蕩。若有溶液顯黃色或橙色，則說明提取液中含有黃酮。

1.2.4 黃酮含量的測定［7］

準確吸取 0.2mg/mL的蘆丁標準溶液 0.00 mL，0.50mL，1.00mL，1.50mL，2.00mL，2.50mL，3.00mL分別置于25mL比色管中，各加入5%NaNO20.30mL，搖勻，放置6min;加10%Al(NO3)30.30mL，搖勻，放置6min;加4%NaOH 4.00mL，用70%乙醇溶液定容到10mL刻度線，搖勻，放置10min后，以試劑空白為參比，在510nm波長下測定吸光度，并繪制標準曲線。由標準曲線可得回歸方程。

準確吸取滇大薊樣品液1.00mL于25mL比色管中，順序加入5%NaNO20.30mL、10%Al(NO3)30.30mL、4%NaOH 4.00mL，用同濃度乙醇定容到10mL，在510nm波長處以試劑空白作為參比測定吸光度。

將所測吸光度代入回歸方程，求出樣品液中黃酮濃度，按下式計算黃酮提取得率:

黃酮提取得率 (%)=［(C×V×n)/(M×1000)］×100% (1—1)

式中:C—樣品液中黃酮的濃度 (單位:mg/mL);V—樣品液體積 (單位mL);n—稀釋倍數;M—滇大薊粉末的質量 (單位:g)。

1.2.5 提取條件的單因素實驗

稱取3.0g滇大薊粉末，按1.2.2方法提取黃酮，過濾，濾液轉移到50mL容量瓶中，并用相應乙醇定容，制得樣品液。按1.2.4方法顯色后，在510nm波長處測定其吸光度，平行實驗三次。分別進行乙醇濃度、料液比、提取溫度及提取時間的選擇。

1.2.6 最佳提取條件的選擇

在單因素實驗的基礎上，進行L9(34)正交實驗，確定最佳提取條件。

1.2.7 滇大薊提取液對羥基自由基 (·OH)的清除作用［8—9］

參照Fenton反應［10］的方法建立反應體系模型。采用固定反應時間法，在510nm波長處測反應液的吸光度，并與空白液比較。

反應體系為:在10mL比色管中加入9mmol/LFeSO4溶液2.00mL，9mmol/L水楊酸－乙醇溶液2.00mL，不同體積的滇大薊提取液，最后加8.8mmol/LH2O22.00mL啟動反應，加蒸餾水定容，將反應體系置于37℃的水浴中反應30min，以蒸餾水為參比，以試劑空白作比較，在510nm處測定吸光度。考慮到提取液自身的吸光度，在10mL比色管中加入9mmol/LFeSO4溶液2.00mL，9mmol/L水楊酸－乙醇溶液2.00mL，不同體積的滇大薊提取液，加蒸餾水定容，反應體系也置于37℃的水浴中反應30min，作為提取液的本底吸收。重復實驗三次，并與BHT溶液和蘆丁溶液為對照，比較三者對羥自由基的清除能力。

清除率計算公式:·OH清除率 (%)={［A0－ (Ax－Ax0)］/A0}×100% (1—2)

式中:A0—空白對照溶液吸光度;Ax—提取液吸光度;Ax0—不加H2O2的提取液的本底吸光度。

2 結果與分析

2.1 提取液定性檢驗結果

按1.2.3對滇大薊提取液進行定性檢驗，結果如表2—1所示。

表2—1 提取液定性檢驗結果

由表2—1結果可看出，滇大薊的提取液與上述試劑的反應現象和黃酮與這些試劑的反應現象相吻合，說明滇大薊的提取液中含有黃酮類化合物。

2.2 黃酮含量測定標準曲線

按1.2.4進行實驗，以濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線，結果如圖2—1所示。

由標準曲線得回歸方程:A=9.9429C－0.00314，R=0.9998。

2.3 提取條件的單因素實驗結果

按1.2.5方法進行實驗，結果如圖2—2、如圖2—3、如圖2—4、如圖2—5所示。

圖2—1 蘆丁標準曲線

圖2—2 乙醇濃度的選擇

由圖2—2可看出，在其他條件不變的情況下，樣品液的吸光度隨乙醇溶液濃度的增大而增高，當乙醇溶液濃度為60%時達到最大值，此后隨著乙醇溶液濃度的升高，樣品液吸光度下降。當乙醇體積分數超過60% 時，高濃度的乙醇反而會導致原料細胞膜性狀改變而使得總黃酮難以從細胞中提出，從而導致黃酮提取得率降低［11］。故選用60%的乙醇溶液作提取劑較適宜。

圖2—3 料液比的選擇

圖2—4 提取溫度的選擇

由圖2—3可看出，在其他條件不變的情況下，滇大薊中黃酮的提取得率隨料液比的增大而增大，當料液比為1∶30時黃酮提取得率最大，此后隨著料液比的增大，提取得率下降，因此，從滇大薊中提取黃酮時宜采用1∶30的料液比。

由圖2—4可看出，在其他條件不變的情況下，樣品液的吸光度隨著提取溫度的升高而增大，70℃時到達最大，此后隨著提取溫度的升高，樣品液吸光度降低。原因是溫度過高，一些蛋白質、糖類等物質大量溶出，導致提取液粘性加大，雜質溶出量增加，從而導致提取率下降［11］，近而導致樣品液吸光度降低，因此，從滇大薊中提取黃酮時提取溫度選用70℃較為適宜。

圖2—5 提取時間的選擇

由圖2—5可看出，在其他條件不變的情況下，樣品液的吸光度隨著提取時間的增加而增大，在3h時達到最大值，此后隨著提取時間的增長，樣品液吸光度下降。因此，從滇大薊中提取黃酮時提取時間選用3h較為適宜。

2.4 最佳提取條件的選擇

根據單因素實驗結果，進行L9(34)正交實驗。選定的正交實驗因素如表2—2，正交實驗結果如表2—3所示。

表2—2 正交實驗因素水平表

表2—3 正交實驗結果

從表2—3可以看出，四個因素對滇大薊中黃酮提取得率的影響程度是C(提取溫度)﹥A(乙醇濃度)﹥D(提取時間)﹥B(料液比)，最佳提取條件為A2B2C3D3，即:乙醇濃度為60%，料液比為1∶30，提取溫度為80℃，提取時間4h。

在最佳提取條件下進行三次平行實驗，結果如表2—4所示。

表2—4 最佳提取條件下實驗結果

由表2—4可知，在最佳條件下提取黃酮，平均提取得率可達0.163%。

2.5 滇大薊提取液對羥基自由基 (·OH)的清除作用結果

按1.2.7方法進行實驗，結果如圖2—6所示。

由圖2—7可知，同濃度同體積的滇大薊提取液、蘆丁溶液和BHT溶液對羥基自由基的清除能力為:滇大薊提取液＞蘆丁溶液＞BHT溶液，滇大薊提取液的清除效果較好。

圖2—6 滇大薊提取液、蘆丁溶液和BHT對羥自由基的清除

3 結論

用乙醇作為提取劑提取滇大薊中的黃酮，最佳提取條件為:60%的乙醇溶液，料液比1∶30(g/mL)，提取溫度為80℃，提取時間為4h，在此條件下，黃酮提取率可達0.163%。

同濃度同體積的滇大薊提取液、蘆丁溶液和BHT(二丁基羥基甲苯)溶液對羥基自由基(·OH)的清除效果為:提取液＞蘆丁溶液＞BHT溶液，表明滇大薊提取液能較好的清除羥基自由基。

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