重金屬汞離子免疫分析方法的研究

王玉珍，馮 鋒，秦 君，白云峰，王海雁

(山西大同大學化學與化工學院，山西 大同 037009)

重金屬汞離子免疫分析方法的研究

王玉珍，馮 鋒*，秦 君，白云峰，王海雁

(山西大同大學化學與化工學院，山西 大同 037009)

快速定量檢出環境及食品中的重金屬離子已成為世界范圍內的研究熱點。免疫分析方法具有靈敏度高、特異性強、速度快、成本低、容易操作等優點，被廣泛應用到環境和食品中重金屬離子的檢測中。本文主要介紹了重金屬汞離子抗原制備過程中雙功能試劑的選擇、單克隆抗體的制備以及免疫分析方法的建立，并且就其與新型分析方法的結合趨勢進行了探討。

汞離子；免疫分析；單克隆抗體；雙功能試劑

自然條件下，重金屬一般以天然豐度廣泛存在。但是，隨著現代社會的不斷發展，人們在工農業生產活動中對重金屬的使用和接觸越來越頻繁，使得重金屬對人類健康和自然環境產生了嚴重的不良影響。研究發現，攝入過量的重金屬可以導致人體中毒，它能抑制人體酶的活性[1]，擾亂正常新陳代謝，引起心血管疾病，還能致畸[2]。重金屬污染不可逆、廣泛而隱蔽，且與多種污染物形成的復合物能規避常規檢測方法。

汞是一種高污染、強毒性重金屬，自然界的汞主要來源于海洋和火山噴發，但人類活動是汞污染的主要來源，如金礦冶煉、廢物排放和燃料燃燒等。無機汞最穩定的狀態是二價汞離子(Hg2+)，它會對人的神經系統、腎臟和內分泌系統造成很大的損傷；此外，河流和海洋中的微生物會使汞甲基化，形成甲基汞(CH3Hg+)，通過生物富集作用和食物鏈進入人體，嚴重影響人類健康。因此，建立能夠快速定量檢出環境及食品領域中痕量汞離子的方法具有重要意義。

傳統檢測汞離子的方法有分光光度法[3]，冷蒸氣原子熒光光譜法[4-5]，氫化物發生原子熒光光譜法[6]，電感耦合等離子體發射光譜法[7]等。雖然這些方法可以準確測定分析物，但是樣品預處理繁瑣、儀器昂貴、測定時間長且無法用于現場檢測。同上述方法相比，免疫分析方法具有靈敏、快速、簡便、成本較低、特異性強和可以用于現場檢測等優點，該方法是基于抗原抗體特異性結合的一種分析方法，已被廣泛應用于環境監測、食品安全、生物醫療等方面。無論是大分子蛋白和小分子物質均可以用這種方法檢測，如蛋白分子、殺蟲劑、農藥、獸藥、重金屬等[8-11]。

關于重金屬離子的免疫檢測模式劉功良[12]等做了詳細報道，如熒光偏振免疫檢測方法[13](一般用于多克隆抗體)，酶聯免疫吸附分析方法，一步競爭性免疫檢測法[14]，KinExA免疫檢測法[15]等，而應用最多的是酶聯免疫吸附分析方法。酶聯免疫吸附分析方法主要包括抗原的制備、抗體的制備及分析方法的建立，本文主要對該方法的研究進展進行綜述。

1 汞離子抗原的制備

1.1 常用汞離子抗原的制備方法

抗體的制備是建立免疫分析方法的基礎，而抗體制備的關鍵是抗原的修飾，只有得到合理修飾的抗原，才能免疫動物產生優良的抗體。重金屬離子本身分子量很小，沒有免疫原性，無法直接對其進行修飾，所以重金屬抗原的制備非常關鍵。目前，常用的方法是選擇一種合適的雙功能螯合劑，既能與蛋白連接，又可以與重金屬離子形成螯合物，從而被動物免疫系統識別。常用的雙功能螯合劑如圖1(a-e)所示[16-17]，分別是乙二胺四乙酸(EDTA)，異硫氰酸苯基-EDTA(ITCBE)，二乙烯三胺五乙酸(DTPA)，反式-環己基-二乙烯三胺五乙酸(CHXDTPA)和5-異硫氰酸苯基-1，10-菲羅啉-2，9-二羧酸(DCP)。

圖1 重金屬離子免疫分析常用雙功能試劑(a-e)和新雙功能試劑(f)的結構

Wylie[18]等人最初用谷胱甘肽絡合汞離子，制備了汞離子的抗原，并制備出了抗汞離子的單克隆抗體，將金屬離子的免疫分析方法應用到了實際中。隨后，Blake等人采用了EDTA類雙功能試劑制備了不同金屬離子的抗原，如汞、鎘、鉛、鈾和鉻等[19-24]。這些研究成果，為重金屬離子免疫分析方法的深入研究奠定了基礎。

1.2 汞離子抗原制備方法的進一步研究

研究表明，上述方法在制備重金屬離子的抗原時，金屬離子被螯合劑包裹在里面，不能直接作為抗原決定簇的一部分刺激動物的免疫系統，所以得到的抗體絕大部分是針對金屬-螯合劑的復合物整體的，而不能單獨識別金屬離子。這樣得到的抗體必須是和螯合劑的親和力很小，而對金屬-螯合劑復合物有很強的親和性和特異性。而且這種方法制備的抗體與其他金屬離子的交叉反應較大，樣品處理時要預先螯合，過程較為繁瑣。如果選擇一種新的雙功能試劑，使其與重金屬離子連接后，能夠將金屬離子暴露出來作為抗原決定簇免疫動物，得到針對單獨的金屬離子的抗體，這樣在樣品處理時不需要預先螯合，就能直接檢測金屬離子，使檢測過程在很大程度上得到簡化。

基于以上理論，我們以汞離子為研究對象[9]，選用帶有羧基和巰基并含環狀剛性結構的6-巰基煙酸(MNA)(圖1f)為雙功能試劑，羧基通過活化酯法與載體蛋白連接，巰基與汞連接。這樣交聯制得的免疫原，汞離子能夠暴露出來作為抗原決定簇刺激動物免疫系統，從而得到針對單獨汞離子的抗體。

2 汞離子抗體的制備及免疫分析方法的建立

在成功制備了合理修飾的免疫原后，取合適劑量免疫BALB/C小鼠，待檢測小鼠血清的效價達到要求后，即可取脾細胞與骨髓瘤細胞融合，通過細胞培養、間接競爭ELISA篩選，亞克隆等得到特異性的單克隆抗體。

我們運用自制的汞離子抗體，建立了測定汞離子的間接競爭ELISA法[9]。通過優化實驗條件，在汞離子濃度范圍為0.1～100 ng/mL的情況下，測定汞離子間接競爭ELISA法的IC50和LOD分別為1.12 ng/mL和0.08 ng/mL，表明方法具有很高的靈敏度，可以準確、快速、簡單地檢測環境以及食品中的汞離子。樣品不需加入螯合劑就可直接測定，使檢測過程更為簡單。該方法為汞離子的檢測提供了新的手段，同時，為重金屬離子免疫分析方法的深入研究提供了一定的理論基礎。

3 重金屬離子免疫分析方法展望

傳統的酶聯免疫分析方法雖然方便、快速，但是靈敏度還不夠高，目前重金屬的免疫分析大部分集中于ELISA法，與其它分析方法結合較少，為了進一步提高方法的靈敏度及使檢測更加方便，與其它分析方法聯用檢測重金屬離子是未來發展的趨勢。

3.1 基于表面增強拉曼光譜的重金屬離子免疫分

析方法研究

表面增強拉曼光譜(SERS)用于標記免疫檢測是標記免疫學與SERS相結合的一門新型的研究技術[25]。SERS應用于標記免疫分析，靈敏度非常高，甚至優于熒光[26]。常見的SERS標記免疫技術主要基于類似三明治結構的構建，即基底上的固相抗體與標記抗體通過與抗原結合形成“固相抗體-待測抗原-標記抗體”夾心復合物，通過對標記抗體中的拉曼活性分子SERS信號的識別進行免疫分析，這種模式主要用于大分子的檢測。目前，Guichi Zhu等[27]將SERS應用到了鹽酸克倫特羅的免疫分析方法中。由于小分子抗原只有單一的抗原決定簇，在進行免疫分析時，一般都采用競爭法，即包被抗原與待測物競爭與標記抗體反應，這既提高了方法的靈敏度，也將小分子免疫分析引入了一個新的研究領域。

用SERS檢測重金屬離子(銅離子)的方法袁亞仙等[28]已有報道，方法雖然應用了夾心法模式，但是并沒有涉及到抗原抗體的反應，所以將重金屬離子免疫分析方法與SERS結合是我們未來的研究方向之一。

3.2 膠體金免疫層析技術應用于重金屬離子檢測

方法的研究

膠體金免疫層析技術(CGICA)是將膠體金的標記技術與層析技術相結合建立起來的一種簡單快速的方法。相較于其他免疫分析方法具有很多優點：方便快捷，檢測所需時間短，只需要幾分鐘就可判定檢測結果；不需要任何儀器和設備，肉眼即可觀察；可以用于現場臨時檢測，方便攜帶；成本較低，操作簡單；所需試劑較少，并且膠體金可以穩定保存，受外界影響較小[29-30]。

關于重金屬的膠體金試劑條也已有報道，劉斌和向軍儉[31-32]等制備了抗鎘-EDTA的單克隆抗體，建立了膠體金免疫層析法快速測定鎘離子，可以用來分析水樣中的重金屬鎘的含量。Yong Tang[33]等制備了抗鉛-DTPA的單克隆抗體，并研制出試劑條檢測水樣中的鉛。我們擬將自制的汞離子單克隆抗體應用到膠體金試劑條的制備中，希望利用抗體可以直接檢測單獨的汞離子和樣品不需要預先螯合的優點，建立檢測汞離子的膠體金試劑條。這將為汞離子膠體金試劑條的市場化提供理論基礎。

4 總結

重金屬離子的免疫分析方法較傳統檢測方法而言，具有靈敏度高、特異性強、成本低廉等優點，但是它只是一種輔助方法，并不能代替傳統的方法。重金屬離子的免疫分析方法仍然有很多需要改進的地方，將免疫分析方法與其它高靈敏度、快速準確的方法結合是非常必要的。這對于環境、食品中重金屬離子的檢測有很大的意義。

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〔責任編輯 楊德兵〕

The Research of Mercury I ons I mmunoassay

WANG Yu-zhen，FENG Feng，QIN Jun，BAIYun-feng，WANG Hai-yan
(School of Chemistry and Chemical Engineering，Shanxi Datong University，Datong Shanxi，037009)

Currently，h igh heavymetal pollution also causes a big threat to the public health.Due to its properties such as high sensitivity and specificity，rapid，simple of immunoassay，it has been widely used for the determination of heavymetals in food and environmental areas.This paper described the selection of bifunctional reagents in the preparation ofmercury ions antigen and the establishmentof immunoassaymethod.In addition，the trends of immunoassay combined with new analyticalmethodswere discussed.

mercury ions；immunoassay；monoclonal antibody；bifunctional reagent

X830.2

A

2013-04-10

國家自然科學基金資助項目［21175085］；山西省自然科學基金資助項目［2009011015－1］

王玉珍（1983－），女，山西朔州人，博士，講師，研究方向：生物分析；*馮鋒，男，博士，教授，通信作者。

1674－0874（2013）03－0040－03