氣滯血瘀證大鼠NO/NOS體系的變化

寧天一 王婷婷 姜 靜 程嘉藝

(遼寧中醫藥大學，沈陽，110032)

氣滯血瘀證是指氣機阻滯而致血行瘀阻所表現的證候。常因情志不遂，閃挫外傷或寒邪內阻等所引起。臨床表現胸脅脹滿或走竄疼痛，性情急躁，脅下痞塊，刺痛拒按，入夜更甚，或婦女痛經，經色紫暗，夾有瘀塊，舌紫暗或有瘀斑等。氣是人體內至精至微的生命物質，是生命活動的重要物質基礎，具有推動血液的生成、運行，以及津液的生成、輸布和排泄等功能。中醫“氣”的概念較難把握，但“氣”畢竟是物質的，有其物質基礎才能完成其重要功能。為了初步探討 “氣”的本質與氣體信號分子的相關性，本實驗復制氣滯血瘀病癥模型，觀察其模型體內氣體信號分子NO的變化情況，研究是否與中醫理論中的“氣”存在相關性，為血瘀證及活血化瘀方藥的研究提供一個新的思路。

1 材料與方法

1.1 試劑 NO試劑盒(20111123)、NOS試劑盒(20111123)(南京建成生物工程研究所)，Trizol(D9108A)、RT－PCR試劑盒(DRR019A)、瓊脂糖(D601)、Marker(D526A)引物(寶生物工程(大連)有限公司)。

1.2 實驗動物與分組 SPF級健康wistar大鼠，雌雄各半，體重180g～200g，隨機分成4組，分別為對照組、模型組、血府逐瘀湯低劑量組和高劑量組。

1.3 復制模型 采用多因素聯合刺激法造模［1］。刺激因素包括聲、光、電、冰水浴、束縛、夾尾，每天刺激2次，持續5周時間。

1.4 血漿NO含量測定 NO產生后在體內迅速轉化亞硝酸鹽(NO2－)和硝酸鹽(NO3－)，而 NO2－又進一步轉化為NO3－。利用硝酸還原酶特異性地將NO3－還原NO2－，通過顯色深淺測定 NO2－濃度高低［2］。

1.5 肝組織TNOS和iNOS活性測定 按NO和NOS檢測試劑盒說明書操作，測定NO合酶(TNOS)、誘導型NO合酶(iNOS)活性，結構型NO合酶(cNOS)活性=TNOS活性－iNOS活性。

1.6 RT－PCR法測定肝組織eNOS基因表達 參照文獻［3－4］采用 Trizol試劑提取總 RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書進行反轉錄合成cDNA，以此為模板進行PCR擴增。反應條件eNOS、β－actin退火溫度65℃。采用凝膠成像分析儀掃描，測定目的基因和β－actin擴增的A，計算其與β－actin的比值，見表1。

表1 eNOS和肌動蛋白基因引物序列

1.7 頸總動脈eNOS免疫組織化學分析 頸總動脈石蠟切片常規脫蠟水化，3%過氧化氫消除內源性過氧化物酶15min，微波法抗原修復10min，滴加一抗，4℃過夜，次日順序加入二抗和三抗，分別 37℃孵育30min，DAB顯色，蘇木精復染，光鏡下觀察eNOS在頸總動脈內皮細胞中表達情況［5］。用彩色病理分析系統測定eNOS陽性細胞的著色灰階值?；译A值越小，說明著色越深，反映eNOS表達量越多，以灰階值來進行量化后行統計學分析。

2 結果

2.1 血漿和肝組織NO含量及肝組織中酶活性檢測與對照組相比，模型組血漿和肝組織中NO含量明顯降低(P＜0.01)，低劑量組血漿及肝組織中NO含量明顯高于模型組(P＜0.05)。與對照組相比，模型組TNOS、cNOS活性均明顯降低(P＜0.01)，低劑量組TNOS、cNOS活性明顯高于模型組(P＜0.05)，見表2。

2.2 肝組織eNOS基因表達 肝組織eNOS基因表達水平:與正常對照組相比，模型組肝組織eNOS基因表達水平明顯降低(P＜0.01)，低劑量組肝組織eNOS基因表達水平明顯高于模型組(P＜0.05)，見圖1。

表2 氣滯血瘀證大鼠血漿及肝臟中NO含量及酶活性的變化(n=8，s)

表2 氣滯血瘀證大鼠血漿及肝臟中NO含量及酶活性的變化(n=8，s)

注:與對照組比較，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，△P＜0.01，△△P ＜0.05。

分組 劑量(生藥量/kg)血中NO(μmol/L)肝組織NO(μmol/mg)TNOS酶活性(U/mg)cNOS酶活性(U/mg)2.77±1.73 5.87±1.72 0.31±0.04 0.19±0.04模型組 0.52±0.33＊＊ 0.52±0.24＊＊ 0.19±0.02＊＊ 0.04±0.01＊＊低濃度 15 2.37±0.53△△ 3.72±1.53△△ 0.24±0.02△△ 0.10±0.04△高濃度 15 1.88±1.04 2.26±1.28 0.22±0.02△△對照組0.04±0.05

圖1 大鼠肝組織中NOS基因表

2.3 頸總動脈eNOS免疫觀察 與對照組比較模型組頸總動脈eNOS灰階值明顯升高(P＜0.05)，與模型組比較低劑量組頸總動脈eNOS灰階值明顯降低(P＜0.05，見表3、圖2。

圖2 大鼠頸總動脈內皮細胞NOS(×200)

表3 氣滯血瘀大鼠肝組織eNOS蛋白表達(n=6，s)

表3 氣滯血瘀大鼠肝組織eNOS蛋白表達(n=6，s)

注:與對照組比較，＊＊P＜0.01;與模型組比較，△P＜0.05。

0.18±0.01模型組 6 0.27±0.03＊＊低劑量組 6 15 0.21±0.07△高劑量組灰階值對照組組別 鼠數(只)劑量(mL/kg)6 15 0.22±0.05 6

3 討論

一氧化氮是一種化學性質比較活潑的親脂性小分子化合物，在生物體內由左旋精氨酸在NOS作用下最終生成，能夠持續產生并透過生物膜自由擴散，具有舒張血管，降低血壓等生理功能，在心血管系統、免疫系統和神經系統中起著重要的作用［6］。臨床上應用硝基類舒血管藥物已有一百多年，隨著研究的深入，人們了解其作用機制，實際上是作為NO供體。硝基類舒血管藥物引起的血管舒張作用直接取決于NO的生成量，并存在量效關系，對血瘀證有治療作用的硝基類舒血管藥物本質是通過氣體信號分子發揮作用［7］。氣滯血瘀證的形成是一個比較漫長的過程，與情緒、飲食、年齡、環境、疾病等諸多因素有關。中醫認為精神情志活動是以臟腑所化生和貯藏的精氣血為物質基礎，而肝主疏泄在志為怒，怒以肝藏血為物質基礎，肝貯藏血液、調節血流量及防止出血有賴于肝疏泄氣機得以實現。本試驗中大鼠經多因素聯合刺激致使情志發生改變，長期處于暴怒狀態，從而建立了氣滯血瘀模型。實驗結果顯示氣滯血瘀證NO含量和NOS表達水平明顯降低(P＜0.01)，給予行氣活血藥后NO含量和NOS表達水平顯著性增加(P＜0.01)，二者變化趨勢一致，這也驗證了NO舒張血管功能，研究揭示行氣活血藥可以上調NO/NOS體系。有研究表明［8］機體組織缺血再灌注后內皮功能受損，組織細胞會形成不可逆性損傷，組織缺血后eNOS活性、eNOS基因表達水平和NO含量均明顯降低，缺血組織恢復灌注后，eNOS活性、eNOS基因表達水平和NO含量低于基礎值，恢復灌注2 h，上述指標接近基礎值，這是機體自我保護的一個過程。中醫理論中“氣”是存在于人體內的至精至微的生命物，是生命活動的重要物質基礎，具有很強的活力，能夠推動血液的生成、運行，以及津液的生成、輸布和排泄等作用，存在生命物質和生理功能雙重屬性。中醫關于“氣為血之帥，血為氣之母，氣行則血行，氣滯則血瘀”的論述，反映了氣血在生理病理方面的相互作用和相互致病的密切關系。進一步深入探討氣的本質和氣血關系，可以為治療血瘀證提供新的途徑，將對中西醫結合血瘀證的研究具有重要的意義。

［1］王婷婷，賈乘，陳宇，等.大鼠氣滯血瘀證模型的建立及影響因素分析［J］.中國中藥雜志，2012，37(10):1692 －1633.

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