高效液相色譜法測定靈芝提取物中尿苷和腺苷含量

盧端萍 ，蔣婷婷 ，陳 碩，王 勇

(1.福建省藥品檢驗所，福建 福州 350001; 2.福建省立醫(yī)院，福建 福州 350001)

靈芝為多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum(Leyss ex Fr.)Karst.或紫芝Ganoderma sinenseZhao，Xu et Zhang 的干燥子實體[1]，具有補(bǔ)氣安神、止咳平喘等功效。靈芝中主要含有多糖[2]、三萜[3－4]、核苷[5]、生物堿[6]、黃酮[4]、氨基酸及微量元素等多種化學(xué)成分，具有護(hù)肝、抗炎、抗高血壓、抗腫瘤、調(diào)血脂、免疫調(diào)節(jié)等功能[7]。靈芝提取物作為靈芝類產(chǎn)品的主要原料之一，很有必要對其質(zhì)量進(jìn)行控制。筆者建立了可同時測定靈芝提取物(赤芝提取物和紫芝提取物)中尿苷和腺苷含量的反相高效液相色譜(RP－HPLC)法，并測定了不同產(chǎn)地的靈芝提取物中尿苷和腺苷的含量，為靈芝提取物的質(zhì)量評價提供參考。

1 儀器與試藥

Waters Acquity UPLC超高效液相色譜儀，包括二元泵、二極管陣列檢測器、自動進(jìn)樣器，Empower色譜工作站;超聲波清洗器(昆山儀器有限公司);超純水器(賽多利斯)。靈芝提取物(將從全國不同產(chǎn)地收集的赤芝和紫芝子實體，由福建仙芝樓生物科技有限公司采用相同的提取工藝，即水提、濃縮、干燥制得);尿苷對照品(批號為 887－200001)、腺苷對照品(批號為 110879－200202)，均購自中國藥品生物制品檢定所;乙腈為色譜純，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱:Agilent ZORBAX SB－Aq柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:乙腈(A)－水(B)，按表1進(jìn)行梯度洗脫;流速:0.8 mL/min;檢測波長:260 nm。柱溫:室溫;進(jìn)樣量:5 μL。理論板數(shù)按尿苷算應(yīng)不低于5 000。在此色譜條件下，尿苷和腺苷與其他組分分離較好，色譜圖見圖1。

表1 流動相梯度洗脫程序

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

取尿苷、腺苷對照品適量，精密稱定，加10%甲醇制成每1 mL含尿苷 100 μg/mL、腺苷 10 μg/mL的混合溶液，即得對照品溶液。取本品0.2 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入10%甲醇25 mL，稱重，超聲處理5 min，補(bǔ)足減失質(zhì)量，濾過，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:精密稱取尿苷、腺苷對照品適量，加10%甲醇分別制成含尿苷 195.6 μg/mL、腺苷 105.6 μg/mL 混合對照品溶液，精密吸取 0.25，0.50，1.00，2.00，5.00，10.00 mL，置10 mL容量瓶中，加10%甲醇稀釋至刻度。以峰面積(mAU)為縱坐標(biāo)、對照品質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，尿苷為Y=15.426X－ 2.331 8(r=1.000 0)，腺苷為Y=21.252X－3.457 9(r=1.000 0)。結(jié)果表明，尿苷和腺苷質(zhì)量濃度分別在 4.89 ～195.6 μg/mL 和 2.64 ～105.6 μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

精密度試驗:取同一對照品溶液，按擬訂的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果尿苷和腺苷色譜峰峰面積的RSD分別為1.7%和1.9%(n=6)，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗:取同一赤芝提取物(1號)樣品6份，按2.2項下方法制備供試品溶液，按擬訂的色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果尿苷和腺苷含量分別為 12.09 mg/g和 1.04 mg/g，RSD分別為1.66%和1.89%(n=6)，表明方法具有良好的重復(fù)性。

穩(wěn)定性試驗:取同一供試品溶液，分別于 0，2，4，8，12，18，24 h時進(jìn)樣，按擬訂的色譜條件測定。結(jié)果尿苷、腺苷含量的RSD分別為0.28%和1.44%(n=7)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗:取已知含量的赤芝提取物(1號)樣品0.1 g，精密加入與樣品中含有量相當(dāng)?shù)哪蜍蘸拖佘諏φ掌罚垂┰嚻啡芤褐苽浞椒ㄖ苽浯郎y溶液，按擬訂的色譜條件測定，計算回收率。結(jié)果見表2。

耐用性試驗:考察了不同色譜柱和流動相對赤芝提取物(1號)中尿苷和腺苷的含量測定結(jié)果。結(jié)果見表3，表明該方法耐用性良好。

2.4 樣品含量測定

分別對10批赤芝提取物和8批紫芝提取物樣品進(jìn)行含量測定。結(jié)果見表4。

表2 加樣回收試驗結(jié)果(n=6)

表3 耐用性試驗結(jié)果

表4 赤芝和紫芝提取物樣品含量測定結(jié)果(mg/g)

3 討論

由表4可見，不同產(chǎn)地的赤芝和紫芝提取物中尿苷、腺苷含量及二者總量差異較大，同一產(chǎn)地、不同批次的紫芝或赤芝提取物中尿苷、腺苷含量及二者總量也存在一定差異。不同產(chǎn)地的靈芝提取物中尿苷和腺苷含量差異較大，可能系靈芝不同生長環(huán)境、不同培養(yǎng)基質(zhì)及不同采收季節(jié)等因素影響所致。

曾采用磷酸鹽緩沖液(pH=6.5)－甲醇[1](17∶3)為流動相，后考察不同比例的甲醇－水[8]及乙腈－水[9－10]為流動相，結(jié)果用緩沖鹽和水的分離效果無明顯差異，且用乙腈－水時尿苷和腺苷出峰較快且峰形較好。曾以對水、10%甲醇、20%甲醇作為提取溶劑，考察結(jié)果表明，不同提取溶劑提取的尿苷、腺苷含量無顯著性差異，選擇10%甲醇較合適。還對不同的提取時間(5，10，15，20 min)進(jìn)行考察，結(jié)果超聲提取5 min時樣品中尿苷、腺苷已提取完全。

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