正交試驗(yàn)優(yōu)化固本祛風(fēng)顆粒提取工藝＊

俞 冰，劉志承 ，李曙光 ，徐漢明，曹麗萍

(1.廣東省深圳市中醫(yī)院，廣東 深圳 518033; 2.廣東省深圳市寶安中醫(yī)院，廣東 深圳 518133)

固本祛風(fēng)湯是深圳市中醫(yī)院協(xié)定處方，由黃芪、徐長(zhǎng)卿、蒼耳子、細(xì)辛、葶藶子、甘草等12味中藥組方，用于治療過(guò)敏性鼻炎，臨床應(yīng)用多年，安全有效[1]，但因口感差、使用不便，患者依從性較差，影響其臨床應(yīng)用。為此，改進(jìn)其劑型，研制了固本祛風(fēng)顆粒，并對(duì)其提取工藝進(jìn)行了研究。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

LC－20AT型高效液相色譜儀，ELSD－LTⅡ蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，CTO－10AS vp柱溫箱(日本島津公司);Sartorius BP 211D型電子天平(十萬(wàn)分之一，德國(guó)Sartorius公司);電熱恒溫套，CQ－250－DST型超聲波清洗儀(250 W/40 kHz，上海生析超聲儀器有限公司)。黃芪、徐長(zhǎng)卿、蒼耳子、細(xì)辛、葶藶子、甘草等藥材(購(gòu)自深圳市華輝藥業(yè)有限公司)，經(jīng)深圳市中醫(yī)院藥檢室檢驗(yàn)，均符合藥典標(biāo)準(zhǔn);水為超純水，乙腈為色譜純(美國(guó)Tedia公司);黃芪甲苷對(duì)照品(批號(hào)為110781－200512，中國(guó)藥品生物制品檢定所)。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芪甲苷含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱:GL Inertsil ODS－SP 柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈(A)－水(B)，梯度洗脫，0～12 min，A ∶B=30∶70，12～30 min，A ∶B=32∶68;流速:1 mL/min;柱溫:28℃;氮?dú)鈮毫?360 kPa;蒸發(fā)溫度:40℃。理論板數(shù)以黃芪甲苷峰計(jì)算不低于10 000。在此條件下，色譜圖見(jiàn)圖1。

2.1.2 溶液制備

精密稱取黃芪甲苷對(duì)照品適量，加甲醇配制成質(zhì)量濃度為0.52 g/L的對(duì)照品溶液。藥材加水，按工藝提取，濃縮至100 mL，為貯備藥液;精密量取貯備藥液20 mL，加水飽和的正丁醇溶液振搖提取4次，每次40 mL，合并正丁醇層，用氨試液洗滌2次，每次40 mL，棄去氨試液，正丁醇層水浴濃縮至干，殘?jiān)铀?0 mL，微熱使溶解，通過(guò)D－101型大孔吸附樹(shù)脂柱(12 cm×1.5 cm)，以水50 mL洗脫，棄去水液，再以30%乙醇30 mL洗脫，棄去洗脫液，繼以70%乙醇80 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移至5 mL容量瓶，加甲醇至刻度，搖勻，溶液過(guò)0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。取不含黃芪的方中其他藥材，按供試品溶液制備方法操作，制得陰性對(duì)照品溶液。

圖1 高效液相色譜圖

2.1.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察:取對(duì)照品溶液，分別精密進(jìn)樣 2，5，7，10，15，20 μL，按擬訂的色譜條件測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣量的自然對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)、峰面積積分值的自然對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=1.71X+11.301 5，r=0.999 8(n=6)。結(jié)果表明，黃芪甲苷進(jìn)樣量線性范圍是 1.04 ～10.4 μg。

精密度試驗(yàn):取同一對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，測(cè)定峰面積。結(jié)果黃芪甲苷含量的RSD為1.26%(n=6)。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液，按擬訂的色譜條件分別于0，2，4，6，8，12 h 時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果含量的RSD為 1.31%(n=6)。

重復(fù)性試驗(yàn):取同一貯備藥液5份，分別依法制備供試品溶液并測(cè)定含量。結(jié)果貯備藥液中黃芪甲苷平均含量為0.101 0 g/L，RSD為 1.58%(n=5)。

加樣回收試驗(yàn):精密取已知含量的貯備藥液共9份，每份10mL，分別精密加含黃芪甲苷0.52 g/L的對(duì)照品溶液1，2，3 mL各3份，按供試品溶液制備方法操作，依法測(cè)定峰面積。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 黃芪甲苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.2 干膏得率測(cè)定

將藥液濃縮至100 mL，精密量取25 mL，置干燥至恒重的蒸發(fā)皿，濃縮至干，于105℃干燥至恒重，得干膏，按干膏質(zhì)量與原藥材質(zhì)量的比值，求得干膏得率。

2.3 正交試驗(yàn)

以加水量(因素A)、提取次數(shù)(因素B)、提取時(shí)間(因素C)為考察因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，選用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表2至表4。直觀分析表明，各因素對(duì)提取效果的影響大小依次為提取次數(shù)、加水量、提取時(shí)間，最佳組合為C3A3B3;方差分析結(jié)果表明，因素C為顯著因素，因素A、因素B為非顯著因素。因此，確定最優(yōu)提取工藝為C3A1B1，即每次加8倍量水煎煮1 h，提取3次。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

取處方量藥材3份，按C3A1B1提取工藝，即每次加8倍量水煎煮1 h，共提取3次。濾過(guò)，合并濾液，減壓濃縮至100 mL，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定黃芪甲苷含量。結(jié)果貯備藥液中黃芪甲苷含量分別為0.101 6，0.101 0，0.100 2 g/L，平均 0.100 9 g/L;按 2.2 項(xiàng)下方法測(cè)得的干膏得率分別為 22.1% ，22.3% ，22.3% ，平均 22.2% 。結(jié)果表明，按C3A1B1提取工藝，黃芪甲苷含量和出膏率均基本達(dá)到最大值，說(shuō)明工藝合理可行。

3 討論

黃芪是方中君藥，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、益衛(wèi)固表、利水消腫等功效，具有改善心功能、促進(jìn)代謝、增強(qiáng)機(jī)體免疫、提高應(yīng)激能力等作用[2]。黃芪的提取方法有超濾法、回流法、煎煮法等[3]，黃芪甲苷含量測(cè)定有高效液相色譜－紫外法(HPLC－UV)[4]、高效液相色譜－蒸光散射檢測(cè)(HPLC－ELSD)法[5]、薄層掃描等方法。因HPLC－UV法對(duì)紫外末端吸收的物質(zhì)靈敏度差，薄層掃描法操作煩瑣、重復(fù)性差，而HPLC－ELSD法操作簡(jiǎn)單、快捷、靈敏度高，故選用HPLC－ELSD法。黃芪含黃芪皂苷和黃芪多糖等有效成分，采用水提或醇提時(shí)黃芪甲苷提取量無(wú)顯著性差異，提取率能達(dá)到90% 以上[6]，而水提成本低廉，且黃芪多糖等成分水溶性較好，故采用水提工藝。選擇黃芪甲苷和干膏得率為指標(biāo)，可較好地保證制劑質(zhì)量。

表3 正交試驗(yàn)及結(jié)果

表4 方差分析表

本研究結(jié)果準(zhǔn)確，工藝合理可行，為固本祛風(fēng)顆粒的研制和生產(chǎn)提供了研究資料。

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