紅霉素自乳化制劑處方研究

匡 扶 ，肖廷超 ，朱照靜 ，錢 妍

(1.重慶醫科大學附屬第二醫院藥劑科，重慶 400010; 2.重慶醫科大學圖書館，重慶 400016; 3.重慶醫藥高等專科學校，重慶 400030)

自微乳化給藥系統(self－microemulsifying drug delivery system，SMEDDS)由藥物、油相、非離子型乳化劑和助乳化劑組成，在溫和攪拌下可自發形成O/W型微乳，其粒徑小于100 nm。SMEDDS可顯著提高水難溶性藥物的溶出度、口服吸收率和生物利用度[1]，是近年來藥劑學研究的熱點領域之一。SMEDDS口服后在胃腸道內迅速乳化，藥物可直接進入小腸淋巴系統，后經胸腺淋巴管轉運，不進入肝門靜脈[2]，因此可避免或減小藥物的肝首過效應，提高藥物的生物利用度。SMEDDS一般分裝于軟膠囊中，制備工藝簡單，性質穩定，劑量準確且服用方便。紅霉素是大環內酯類抗生素，近年來，臨床報道其在各種感染和某些非感染性疾病治療中的應用越來越多，如紅霉素可抑制一些抗癌藥從癌細胞內的主動外排，增強抗癌效果，并能逆轉某些惡性腫瘤對抗癌藥的耐藥性[3];能抑制肺間質纖維化的形成[4];對于假單胞菌感染治療有特殊用途[5]。但由于紅霉素為水難溶性藥物，其口服制劑存在不耐酸、溶出難、口服吸收率為18%～45%、生物利用度差等問題[6]，極大地限制了臨床應用，將紅霉素制成SMEDDS有望解決上述問題。

1 儀器與試藥

DF－101B型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鄭州長城科工貿有限公司);AB204－E型分析天平(瑞士Mettler Toledo公司);800型離心機(上海手術器械廠);KQ2200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司儀);Zetasizer Nano納米粒度/zeta電位儀(英國馬爾文儀器有限公司);UV－3150型紫外分光光度計(日本島津株式會社);ZRS－8G型智能溶出儀(天津大學無線電廠)。橄欖油(OLIVE－OIL，盛隆天然藥油有限公司，批號為090535);十四酸異丙酯(isopropyl myristate，IPM，美國Fluka公司，批號分別為1216171，21106124);吐溫80(Tween 80，上海申宇醫藥化工有限公司，批號為090535);聚乙二醇400(PEG400)，天津天泰精細化學品有限公司，批號為20090120);聚氧乙烯蓖麻油(polyoxyethylene castor oil，Cremophor EL，Fluka，批 號 分 別 為1210306，44506130);聚乙二醇 －8－甘油辛酸 /葵酸酯(Labrasol，LAS，法國Gattefosse公司，Lot 33347);紅霉素原料藥(內江山山制藥廠，批號為090301，純度為99.0%);紅霉素標準品(中國藥品生物制品檢定所，批號為30307－200815純度不低于98%)。

2 方法與結果

2.1 紅霉素溶解度測定

在預試驗基礎上選取可形成微乳的油相(IPM，OLIVEOIL)、乳化劑(Tween 80，Cremophor EL)、助乳化劑(LAS，PEG400)進行研究。取上述6種液體各2 mL，分別置10 mL試管中，逐步加入紅霉素原料藥約10 mg(以減量法計量)，每次超聲溶解20 min，溶解平衡室溫25℃靜置30 min，觀察溶解情況，直至飽和，根據《中國藥典》近似溶解度的概念，判斷出各種溶劑中藥物的溶解能力級別。結果見表1。

表1 紅霉素在不同溶劑中的溶解性(n=3)

根據表1結果，可選取溶解度大的IPM作為油相，LAS作為乳化劑。但紅霉素在Cremophor EL和Tween80中溶解度差別不大，試驗中發現超聲溶解過程中體系溫度上升時藥物均溶解，當紅霉素質量濃度大于20～30 g/L時室溫下靜置過夜后OLIVEOIL中的藥物析出。應進一步通過空白偽三元相圖進行比較，確定EM－SMEDDS處方組分以及各組分的比例。

2.2 EM－SMEDDS處方構成確定[7－9]

以 IPM為油相、LAS為助乳化劑，比較Tween 80與Cremophor EL為乳化劑時成乳情況，并確定各組分的最佳比例。通過滴定法繪制出油相－乳化劑/助乳化劑(混合乳化劑)－水體系的偽三元相圖，先將乳化劑與助乳化劑按照Km值為1∶1，2∶1和3∶1(W/W)的比例混合，在三元相圖中記為混合乳化劑(S－cos)，再與油相 IPM 按 Km 值 1 ∶9，2 ∶8，3 ∶7，4 ∶6，5 ∶5，6 ∶4，7 ∶3，8 ∶2，9∶1(W/W)比例混合，37℃水浴，逐滴加入蒸餾水，攪拌混勻，記錄系統狀態變化并用Origin 7.5軟件繪制偽三元相圖。結果見圖1和圖2。可知，Cremophor EL成乳效果優于 Tween80，當 Km相同時，Cremophor EL體系自微乳化區域更大，試驗還發現Cremophor EL體系黏度更小、分散時間更短，有利于在胃腸道內成乳。在油、混合乳化劑和水三者比例固定的情況下，當Cremophor EL含量增加，Km值增大，雖自微乳化區域增大，但偽三元體系的黏度增加，易形成難以分散的稠厚凝膠;當LAS含量增加，Km減小，體系黏度可有效降低，減少凝膠形成;同時提高LAS的比例還可提高載藥量，促進藥物在胃腸體內的吸收。因此，Cremophor EL成乳效果優于Tween 80，選用Cremophor EL為EM－SMEDDS乳化劑，當油相IPM與混合乳化劑比例在2∶(3～8)的范圍內可形成微乳，其中混合乳化劑中Labrasol與Cremophor EL比例在11∶(21～33)的范圍即可。

圖1 以IPM為油相、Tween 80與Labrasol為混合乳化劑的偽三元相圖

圖2 以IPM為油相、Cremophor EL與Labrasol為混合乳化劑的偽三元相圖

2.3 制備方法對制劑粒徑的影響

2.3.1 處方組成和制備溫度

在單因素試驗基礎上，選擇載藥量(X1)、體系中油相比例(X2)、混合乳化劑中Cremophor EL比例(X3)和制備溫度(X4)四者為自變量，自微乳的平均粒徑為因變量(Y)，方案設計成4因素3水平，為使結果更準確，采用擬水平處理成9個水平[10－11]。用U9(95)均勻表設計試驗，見表2。

按表2設計，精密稱取相應油相、乳化劑助、乳化劑和藥物，置西林瓶中，并在對應的水浴溫度下攪拌混合20 min，冷卻至室溫備用。各組取0.05 mL EM－SMEDDS滴入50 mL、37℃恒溫的分散介質(pH=6.8磷酸緩沖液)中，以轉速50 r/min攪拌20 min，取5 mL，用Zetasizer Nano納米粒度儀測定微乳的粒徑和粒徑分布范圍。測定條件為He－Ne激光，測量角度135°，溫度25℃，黏度0.933 cP，反射指數 1.43，波長 632.8 nm。微乳粒徑測量結果見表2。以各組平均粒徑為因變量，用SAS軟件包對各因素進行多元非線性回歸二項式擬合模型，Y=b0+b1X1+b2X2+b3X3+b4X4+b5X21+b6X1X2+b7X22+b8X3X1+b9X3X2+b10X23+b11X4X1+b12X4X2+b13X4X3+b14X24。通過擬合方程的回歸系數r2對方程進行準確性檢測。處理結果可得以下模型，Y=90.390 833 － 0.283 067X1－0.983 000X2－0.451 667X3+0.032 917X4－ 0.000 457X21+0.009 173X2X1(r2=0.999 9，P＜0.000 5)。

表2 均勻設計因素與水平U9(95)及實驗結果

從模型可知4個因素對微乳平均粒徑的影響:當制備溫度(X4)在30～70℃范圍內升高，乳滴平均粒徑變大，故溫度為30℃時平均粒徑最小;混合乳化劑中Cremaonophor EL的比例(X3)在65% ～75%范圍內增大，乳滴粒徑減小，故Cremophor EL占混合乳化劑的75%時粒徑最小;體系中油相所占比例(X2)和載藥量(X1)有交互影響，X3和X4與其他因素間沒有交互影響。為直觀地判斷X2和X1對粒徑的影響，可以固定X3為75%和X4為30℃后，通過ORING75軟件繪制曲面圖，見圖3。可見，當載藥量(X1)為10%、體系中油相所占比例(X2)為20%時，乳滴的平均粒徑最小;固定載藥量10%、制備溫度為30℃時，體系中油相所占比例(X2):20%～40%范圍內，混合乳化劑中Cremophor EL的比例(X3)在65% ～75%范圍內的任意組合均可形成粒徑小于100 nm的微乳。

圖3 固定 X3及 X4時，X1及 X2對平均粒徑作效應曲面圖

綜合考慮到油相IPM是含17個碳的長鏈脂肪酸，在處方中適當增加比例可促進藥物的淋巴轉運吸收，減少紅霉素的首過效應，提高生物利用的目的。從偽三元相圖的繪制過程中也發現，乳化劑Cremophor EL含量增大時體系黏度增大、分散時間延長，助乳化劑LAS比例增加可以促進微乳迅速分散并促進藥物的吸收。因此確定，EM－SMEDDS處方為體系中油相與混合乳化劑比例為3:7，混合乳化劑中LAS與Cremophor EL質量比為7∶13，載藥量為10%，紅霉素自微乳化制劑的乳化后粒徑較小，粒徑分布均勻且分散迅速。

2.3.2 加料順序

水浴30℃時，以IPM為油相、油相與混合乳化劑質量比為3∶7、混合乳化劑中 LAS與Cremophor E質量比為7∶13、載藥量為10%，分別按以下方式加料:油相、乳化劑和助乳化混合均勻后再加入藥物(Ⅰ);藥物溶解于油相后，再與乳化劑和助乳化混合均勻(Ⅱ);藥物溶解于乳化劑后，再加入油相和助乳化混合均勻(Ⅲ);藥物溶解于助乳化劑后，再加入乳化劑和油相混合均勻(Ⅳ);4種物質全部加入后再混合(Ⅴ);油相、乳化劑混合均勻，為空白SMEDDS(Ⅵ)。取上述配制的 EM－SMEDDS 0.5 mL滴入 50 mL、恒溫37℃的水相中，以轉速 50 r/min攪拌 20 min，取5 mL，用Zetasizer Nano納米粒度儀測定微乳的粒徑和粒徑分布范圍。測量條件見 2.3.1 項。結果見表3。

表3 加料順序對微乳粒徑、粒徑分布的影響

可見，加料順序對乳滴平均粒徑和粒徑分布有影響，第Ⅰ和第Ⅳ種方法的微乳粒徑最小，粒徑分布也相對較窄，原因可能是單獨的每一種組份對紅霉素的溶解能力均有限，這兩種方法的混合體系能有效提高對紅霉素的溶解能力;藥物的加入使其形成的微乳粒徑變小。第Ⅰ和第Ⅳ種方法都可制得粒徑小且粒徑分布也相對較窄的EM－SMEDDS，但考慮到后期試驗中需要空白基質與對照，故本試驗中選取第Ⅰ種方法。

2.3.3 自乳化效率

確定EM－SMEDDS處方構成，即以IPM為油相，油相與混合乳化劑質量比為3∶7，混合乳化劑中LAS與Cremophor E質量比為7:13，載藥量為10%。制備方法是30℃水浴，先將油相、乳化劑和助乳化劑混合均勻，然后加入原料藥，溶解混勻即得。用此方法制備3組EM－SMEDDS，采用溶出度測定方法中的小杯法，加入蒸餾水250 mL、37℃恒溫的分散介質(pH=6.8磷酸鹽緩沖液)，精密量取 EM －SMEDDS 0.5 mL，注入杯底部，37 ℃恒溫，以50 r/min攪拌分散，攪拌開始時計時，測定處方的分散時間，并測定所成微乳的平均粒徑和粒徑分布情況[12]。結果見表4。可見，該處方組成的EM－SMEDDS所成微乳平均粒徑小于50 nm，粒徑分布窄，且成乳迅速。

表4 EM－SMEDDS微乳的平均粒徑和分布

2.4 EM－SMEDDS處方構成確定

以IPM為油相，油相與混合乳化劑質量比為3∶7，混合乳化劑中LAS與Cremophor E質量比為7∶13，載藥量為10%，該紅霉素自微乳化制劑的乳化后粒徑較小，粒徑分布均勻且分散迅速。EM－SMEDDS的制備方法先將油相、乳化劑和助乳化劑混合均勻，然后加入原料藥，溶解混勻即得。

3 討論

3.1 處方組成選擇

油相:IPM是天然植物油提取物，對人體無影響，且可與多種乳化劑混合形成微乳，是制備微乳和自微乳的良好油相，而在預試驗中以橄欖油為油相卻難以形成微乳;微乳區面積的大小與油相分子量有關，分子量大的油相難以形成微乳，小分子油相的作用類似于助化劑，易嵌入到乳化劑中，與之形成界面膜，乳化劑對小分子油相的增溶量大于大分子油相。乳化劑:制備O/W微乳一般采用HLB值為10～15的非離子型乳化劑，比離子型乳化劑毒性低，但也會引起胃腸道壁滲透性的可逆性轉變[11];本試驗選取口服安全的乳化劑Cremophor EL，比Tween 80所形成微乳區域較大，不易形成凝膠，容易分散，長期放置較穩定。助乳化劑:助乳化劑的分子嵌入乳化劑分子中共同形成膠束的界面膜，起降低界面張力、增加界面膜的流動性、調節HLB值的作用，由此形成的微乳粒徑較小，口服常用助乳化劑有乙醇、異丙醇、甘油、聚乙二醇、Transcutol(乙二醇單乙基醚)等，因乙醇等揮發性助乳化劑能遷移入明膠膠囊殼中，有可能導致藥物析出，在預試驗中選擇LAS和PEG400作為輔助表面活性劑來考察對微乳形成的影響，結果PEG400作助乳化劑雖能形成微乳，但容易形成凝膠而難以分散，而LAS能明顯降低體系的黏度而容易分散。

3.2 勻設計試驗

因素水平選擇時，載藥量主要依據2.1項下的紅霉素溶解度試驗，體系中油相比例、混合乳化劑中組分比例兩個因素主要是依據2.2項下的空白偽三元相圖。而預試驗中發現，制備溫度對SMEDDS成乳的粒徑有影響，溫度越低，所成微乳的粒徑越小，當溫度高于70度時成乳粒徑大于100 nm，考察無意義。考慮到實際操作過程一般為常溫(25～40)℃，但因混合過程以及攪拌過程都能產生熱量故考察溫度定為30～70℃。勻設計試驗的考察指標為粒徑大小和粒徑分布寬度，沒有將劑型分散時間作為考察指標。因為在預試驗中發現，Km在1∶1～1∶4時之間，油相與混合乳化劑比例為1∶4～1∶1均可在10 min內迅速分散形成微乳符合藥典要求，再以劑型分散時間作為考察指標沒有實際意義。

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