阿托伐他汀對老年大鼠心肌衰老相關指標的影響

韓 磊 李鳴皋 葉 平

1.海軍總醫院全軍航海航空醫學中心，北京 100048；2.解放軍總醫院老年心血管二科，北京 100853

隨著老年人口的逐漸增加，老齡化及其帶來的老齡人口的健康問題正日益成為當前醫學領域面臨的主要問題之一，正確認識衰老發生發展的進程進而揭示其分子機制，成為當前醫學工作者關注的熱點之一。本研究以老年大鼠為研究對象，觀察老年大鼠心肌丙二醛（malondialdehyde，MDA）、脂褐素、衰老特異性β半乳糖苷酶等衰老相關指標的變化及阿托伐他汀干預對上述因素的影響。進而為研究衰老的病理機制和防護措施探索新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 試劑和設備

Wistar大鼠（北京維通利華公司），阿托伐他汀（大連輝瑞制藥有限公司，批號：75837005），衰老特異性β半乳糖苷酶檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），脂褐素檢測試劑盒 （南京建成生物工程研究所），MDA檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），臺式高速離心機 （Sigma公司），高速冷凍離心機（Heraeus Labofuge 400），冰凍切片機（Leica CM1850），水浴鍋（北京長風儀器儀表公司），熒光分光光度計（日本島津RF-5301PC）。

1.2 動物模型建立

購買10個月齡的Wistar大鼠90只（北京維通利華公司），雌雄各半，飼養10～20個月齡。將大鼠隨機分成3個組，每組30只，分別為老年對照組、大劑量和小劑量阿托伐他汀組。大、小劑量阿托伐他汀組分別給予阿托伐他汀[10 mg/（kg·d）、1 mg/（kg·d）]灌胃，老年對照組大鼠灌喂等量的 0.9%氯化鈉溶液。每周定時對大鼠稱重，依據體重情況確定阿托伐他汀的劑量。灌胃4個月后，老年對照組存活大鼠27只，小劑量阿托伐他汀組存活24只，大劑量阿托伐他汀組存活26只。再購入30只3個月齡的Wistar鼠作為青年對照組。

1.3 心肌樣本的制備

灌胃4個月后，常規麻醉后快速取出心臟，部分心肌立即置于液氮中凍存備用；部分心肌于冰凍切片機上，沿與心臟長軸垂直方向進行連續切片，切片厚度為9 μm。將切片置于預冷的丙酮溶液中固定10 min后，儲存于-80℃冰箱中備用。

1.4 心肌脂褐素、MDA含量的測定

采用南京建成生物工程研究所的MDA、脂褐素檢測試劑盒進行。取大鼠心肌樣本，以生理鹽水沖凈血液后，用濾紙吸去多余水分，稱重后放入勻漿器內，加入9倍于組織重量的預冷生理鹽水，在冰浴條件下勻漿，制成10%的組織勻漿液，于4℃條件下3000 r/min離心15 min，取上清液保存。采用熒光法，測定組織中脂褐素的含量；采用硫代巴比妥酸比色法測定心肌MDA含量。

1.5 心肌衰老特異性β半乳糖苷酶含量檢測

采用衰老特異性β半乳糖苷酶檢測試劑盒進行，嚴格按說明書中的方法操作。具體步驟如下：①每個心臟隨機選取3張切片，每張切片加500 μL清理液；②移去清理液，加500 μL固著液，室溫條件下放置10 min；③移去固著液，加500 μL酸性液，室溫條件下放置5 min后移去酸性液（本步驟共重復3次）；④切片平放于濕盒中，加500 μL染色液后，置于濕潤培養箱中，37℃條件下放置12 h，直至切片組織呈現出藍色后移去染色液；⑤加入500 μL清理液，片刻后移去清理液，加中性紅染色液后室溫條件下放置5 min；⑥移去清理液，在切片上加入中性紅染液，室溫下孵育5 min左右；⑦用蒸餾水沖去染色液，將切片在室溫下晾干后用中性樹膠封片。采用Motic Images Advanced 3.2圖像分析系統對結果進行分析，切片中呈藍色的細胞為衰老特異性β半乳糖苷酶陽性細胞。每張切片隨機選取5個不重疊的視野，計數每個視野內的β半乳糖苷酶陽性細胞數，取其平均值作為該切片的陽性細胞數，比較各組大鼠心肌β半乳糖苷酶染色陽性細胞數，并對結果進行統計分析。

1.6 統計學方法

采用統計軟件SPSS 13.0對實驗數據進行分析，計量資料數據以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 衰老大鼠心肌MDA、脂褐素及衰老特異性β半乳糖苷酶含量的變化

與青年對照大鼠相比，老年對照大鼠的心肌MDA、脂褐素及衰老特異性β半乳糖苷酶含量含量均顯著增加（P<0.01），三者表現出相同的變化趨勢。見表1。

表1 青年組與老年組心肌樣本衰老相關指標變化情況（±s）

表1 青年組與老年組心肌樣本衰老相關指標變化情況（±s）

注：與老年對照組比較，**P<0.01

青年對照組（n=30）老年對照組（n=27）326.7±39.5**504.8±40.3 50.9±11.1**98.5±16.3 2.1±0.3**51.9±13.7組別 脂褐素（U/mg）/prot丙二醛（nmol/mg）/prot衰老特異性β半乳糖苷酶（個/HP）

2.2 阿托伐他汀對老年大鼠心肌MDA、脂褐素及衰老特異性β半乳糖苷酶含量的影響

與老年對照組相比，大小兩種劑量阿托伐他汀組的心肌組織中，MDA、脂褐素及衰老特異性β半乳糖苷酶的含量均顯著降低（P<0.01）；其中，與小劑量組相比，大劑量他汀組大鼠心肌組織中的MDA、脂褐素及衰老特異性β半乳糖苷酶含量的下降水平均更為顯著（P<0.01或P<0.05）。見表2。

表2 阿托伐他汀對心肌衰老相關指標含量的影響（±s）

表2 阿托伐他汀對心肌衰老相關指標含量的影響（±s）

注：與老年對照組比較，**P<0.01；與小劑量組比較，#P<0.05，##P<0.01

老年對照組（n=27）小劑量組（n=24）大劑量組（n=26）504.8±40.3 428.1±33.5**394.1±29.6**##98.5±16.3 77.4±14.0**64.3±15.8**##51.9±13.7 37.9±12.9**28.3±8.8**#組別 脂褐素（U/mg）/prot丙二醛（nmol/mg）/prot衰老特異性β半乳糖苷酶（個/HP）

2.3 不同組別間衰老特異性β半乳糖苷酶染色結果比較

心肌組織中衰老特異性β半乳糖苷酶染色陽性的細胞呈現出藍色。對各組樣本心肌組織的衰老特異性β半乳糖苷酶染色結果在顯微鏡下觀察，結果顯示，在高倍鏡視野下，青年對照組大鼠心肌中染色陽性的細胞數非常少（圖1）；老年對照組大鼠心肌中染色陽性細胞數顯著增多（圖2）；大小兩種劑量的他汀組的心肌組織中，染色陽性的細胞數顯著少于老年對照組（圖3、4）；其中，與小劑量組相比，大劑量組的心肌組織染色陽性的細胞數更低（圖3、4）。

圖1 青年對照組大鼠心肌細胞衰老特異性β-半乳糖苷酶染色（200×）

圖2 老年對照組大鼠心肌細胞衰老特異性β-半乳糖苷酶染色（200×）

圖3 小劑量組大鼠心肌細胞衰老特異性β-半乳糖苷酶染色（200×）

圖4 大劑量組大鼠心肌細胞衰老特異性β-半乳糖苷酶染色（200×）

3 討論

當前，在衰老發生的機制方面，主要包括自由基學說、端粒酶學說、線粒體DNA損傷學說及微量元素學說等，而自由基學說在其中有著重要的地位[1]。研究表明[2-4]，代謝過程中產生的大量自由基如超氧陰離子、過氧化脂質等是導致機體衰老的重要原因；過多的自由基會造成細胞膜、線粒體等重要細胞結構的破壞，并可導致蛋白質與酶等的活性發生變化；當這種損傷超過了機體的承受能力時，就可引起細胞分化狀態的改變和喪失，最終導致與加速衰老的發生。

脂褐素、MDA、衰老特異性β半乳糖苷酶等作為反應機體衰老狀態的指標，已為大家所公認，在很多研究中得到應用[5-7]。既往的研究證實[8-10]，MDA、脂褐素、衰老特異性β半乳糖苷酶等在生物體內的含量隨增齡而增高，上述指標在實驗研究中常用于反映機體衰老水平及評價抗衰老干預措施的效果。因此，在本研究中，筆者選擇其作為反映老年大鼠心臟衰老狀態和評價阿托伐他汀干預效果的指標。本研究結果顯示，同青年大鼠相比，老年對照組大鼠心肌的脂褐素水平及MDA含量較青年大鼠顯著增高，同時其衰老特異性β半乳糖苷酶的活性較青年對照組大鼠也顯著增強，表明24個月齡的Wistar鼠的心臟出現了顯著的衰老性的改變，同時也說明本研究所建立的衰老動物模型是成功的。

作為目前臨床中應用最為廣泛的一線調脂藥物，他汀類藥物的作用正日益受到廣大醫學工作者的重視。研究表明[8-11]，除降脂外，他汀類藥物還有著抗炎、抗氧化、保護血管內皮、抑制心肌細胞肥厚等多種作用。近年來，關于他汀類藥物在心血管保護方面的研究有很多，但他汀長期干預在心臟衰老保護方面的研究尚鮮見報道。本研究以老年大鼠為研究對象，觀察阿托伐他汀的長期干預對老年大鼠心肌脂褐素、MDA、衰老特異性β半乳糖苷酶等衰老相關指標的影響。研究發現，給予阿托伐他汀干預后，大鼠心肌的脂褐素含量及衰老特異性β半乳糖苷酶活性均顯著降低，提示阿托伐他汀可以明顯的抑制老年大鼠心肌的衰老性改變；同時，阿托伐他汀干預組的MDA較老年對照組也顯著降低，提示阿托伐他汀對抗大鼠心肌衰老性改變的作用，可能與其對大鼠心臟脂質過氧化水平的抑制有關。筆者既往的研究也顯示，阿托伐他汀的長期干預可顯著增強組大鼠心肌過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、一氧化氮合酶等抗氧化酶的活性，也從另一個側面提示其抗衰老作用可能與其增強抗氧化酶活性，抑制脂質過氧化水平有關。目前，關于阿托伐他汀抗衰老及抗氧化作用的具體機制還不清楚，還需要在今后的工作中進一步研究。

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