復方雙參合劑對小鼠耐缺氧作用的影響

尹東鋒 地里夏提·白克力 趙林雯

1.蘭州軍區烏魯木齊總醫院藥劑科，新疆烏魯木齊 830000；2.新疆尼勒克縣人民醫院藥劑科，新疆尼勒克 835700

我國西部的高原地區環境較為惡劣，特別是缺氧嚴重威脅著當地軍民的身體健康。我國的中藥及其提取物在機體耐缺氧方面有著獨特的優勢，特別是復方中藥功能制劑，作用效果持久穩定，毒副作用小[1]。丹參（Salvia miltiorrhiza）和人參（Panax ginseng）是使用悠久的傳統中藥，現代藥理研究證明，丹參具有擴張冠脈血管、保護心肌、抗腦缺血、改善微循環和抗氧化等藥理作用[2]，筆者前期的實驗已經證明丹參水提取物可以明顯延長小鼠常壓密閉缺氧情況下的存活時間，并且可以改善小鼠KCN中毒狀況，避免小鼠死亡[3]。人參的主要活性成分是人參皂苷，有較強的清除氧自由基的作用，可明顯延長低壓和常壓缺氧條件下小白鼠的存活時間[4]。本實驗將丹參水提取物和人參總皂苷經過組方，考察復方雙參合劑對常壓缺氧小鼠的保護作用，并探討小鼠在急性減壓缺氧條件下，復方雙參合劑對小鼠體內超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、乳酸脫氫酶（LDH）以及腦含水量的影響，為丹參和人參的復方制劑成為重要的抗缺氧藥物提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 昆明種小白鼠100只，全雄，體重18～22 g，由新疆維吾爾自治區實驗動物中心提供，合格證號：SYXK（新）2011-0008。

1.1.2 儀器 超速離心機（上海安亭科學儀器廠，型號：TCL-16B）；電子天平（METTLER TOLEDO AE-240）；全自動酶標儀（上海安泰分析儀器有限公司，型號：AT-858）；低壓低氧動物實驗艙 （貴州風雷航空軍械有限責任公司，型號：FLYDWC50-IA）；秒表。

1.1.3 藥品與試劑 丹參提取物 （西安鴻生生物技術有限公司，批號：100817）；人參提取物（含人參皂苷80%，陜西森費高科實業有限公司，批號：20110312）；紅景天膠囊（四川銀龍藥業，批號：110601）；鈉石灰（威海海格瑞醫療器械有限公司，批號：101206）；SOD ELISA 試劑盒、MDA ELISA 試劑盒、LDH ELISA試劑盒（進口分裝，北京雅安達生物科技有限公司，批號：201201）。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠常壓密閉缺氧實驗 將50只小鼠按體重隨機分成5組，每組10只，分別為空白組、丹參組、人參組、復方雙參組、紅景天組，連續灌胃給藥20 d，于末次給藥1 h后，將各組動物分別放入盛有5 g鈉石灰的250 mL磨口廣口瓶內（每瓶1只小鼠），用凡士林封瓶口，蓋嚴，使之不漏氣，立即計時，以呼吸停止為指標，記錄小鼠存活的時間。

1.2.2 小鼠減壓缺氧實驗 將50只小鼠按體重隨機分成5組，每組10只，實驗分組及給藥方式和劑量同“1.2.1”項下內容。于末次灌胃后1 h，將所有小鼠置于低壓艙內，調整壓力漸減，以3 m/s將裝置內壓力勻速降低，減至相當于海拔7000 m時停止，在此壓力下維持7 h，造成小鼠急性低氧狀態，完成預定缺氧時間后將裝置內壓力升至正常大氣壓，取出小鼠迅速摘眼球取血，分離血清，之后斷頭處死取腦和心臟。其中左半腦用于腦含水量的測定，右半腦及心臟稱重后按 1∶7（M/V）加入 0～4℃的生理鹽水制成組織勻漿，離心，取上清液，和血清進行相關生化指標的測定。

1.2.3 指標檢測 用干濕質量法測定腦含水量，各組取右半腦稱重，置50℃烘箱烘干至恒重，計算腦含水量[腦含水量（%）=（濕重量-干重量）/濕重量×100%]。ELISA 法測定血清，腦勻漿上清液，心臟勻漿上清液中的SOD、MDA及LDH。SOD、MDA和LDH的測定均按照試劑盒說明書進行操作。

1.3 統計學方法

采用統計軟件SPSS 13.0對實驗數據進行分析，計量資料數據以均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 常壓密閉缺氧實驗

與空白組相比，丹參組、人參組、復方雙參組及紅景天組均可顯著延長小鼠存活時間，其中復方雙參組常壓密閉缺氧時間比空白組提高了45.95%（P＜0.01），與陽性對照紅景天組、丹參組和人參組相比，小鼠常壓密閉缺氧時間差異無統計學意義（P＞0.05），結果見表1。

表1 復方雙參合劑對常壓密閉缺氧小鼠存活時間的影響

2.2 對減壓缺氧小鼠腦含水量的影響

與空白組相比，除丹參組外，其余給藥組與空白組相比，可以顯著降低小鼠腦含水量（P＜0.01），人參組、復方雙參組和紅景天組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。結果見表2。

表2 復方雙參合劑對減壓缺氧小鼠腦含水量的影響（%，±s）

表2 復方雙參合劑對減壓缺氧小鼠腦含水量的影響（%，±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與紅景天組比較，△△P＜0.01；“-”代表無數據

空白組（陰性對照）丹參組人參組復方雙參組紅景天組（陽性對照）10 10 10 10 10-0.2 g/kg 0.1 g/kg 0.1 g∶0.2 g/kg 0.6 g/kg 75.63±0.95 76.07±1.08△△74.03±1.08**73.33±0.49**73.68±0.67**組別 動物數（只） 劑量 腦含水量

2.3 對減壓缺氧小鼠腦中生化指標的影響

與空白組相比，給藥組小鼠腦中的SOD含量均有所增加，但是各組間差異無統計學意義（P＞0.05）；給藥組小鼠腦中MDA含量均有所下降，與空白組相比，其中人參組、復方雙參組和紅景天組小鼠腦中MDA含量有顯著降低（P＜0.01），并且復方雙參組與其余各組比較差異有高度統計學意義（P＜0.01）。與空白組相比，給藥各組小鼠腦中的LDH含量均有所下降，除人參組外，其余各給藥組小鼠腦中的LDH含量顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），并且復方雙參組與其余各給藥組比較，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。結果見表3。

2.4 對減壓缺氧小鼠心臟中生化指標的影響

與空白組相比，丹參組小鼠心臟中的SOD含量有所減少，而MDA含量有所增加，但差異無統計學意義（P＞0.05）。人參組中，小鼠心臟中的SOD含量與空白組相比顯著增加（P＜0.05），與復方雙參組和紅景天組相比差異無統計學意義（P＞0.05）；MDA含量與與空白組相比顯著增加（P＜0.01），但顯著低于復方雙參組（P＜0.01）。空與空白組相比，復方雙參組和紅景天組小鼠心臟中的SOD含量顯著增加（P＜0.01），并且MDA含量顯著減少（P＜0.05或P＜0.01），而復方雙參組小鼠心臟中的MDA含量顯著低于紅景天組（P＜0.01）。結果見表4。

表3 復方雙參合劑對減壓缺氧小鼠腦中生化指標的影響（±s）

表3 復方雙參合劑對減壓缺氧小鼠腦中生化指標的影響（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與紅景天組比較，△△P＜0.01；“-”代表無數據；SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛；LDH：乳酸脫氫酶

空白組（陰性對照）丹參組人參組復方雙參組紅景天組（陽性對照）10 10 10 10 10-0.2 g/kg 0.1 g/kg 0.1 g∶0.2 g/kg 0.6 g/kg組別 動物數（只） 劑量183.84±17.92 195.10±35.20 197.56±24.96 199.53±38.58 194.21±21.43 SOD（U/mL）6.13±0.36 5.94±0.51△△4.92±0.52**3.76±0.62**△△4.87±0.66**9.00±0.67 8.03±0.76*△△8.22±1.55△△3.44±1.12**△△4.78±1.13**△△MDA（nmol/mL） LDH（IU/L）

2.5 對減壓缺氧小鼠血清中生化指標的影響

與空白組相比，給藥各組小鼠血清中的SOD含量均有所增加，除丹參組外，其余給藥組與空白組相比較，小鼠血清中的SOD含量有顯著性的增加（P＜0.01），復方雙參組與其它給藥組相比差異有高度統計學意義 （P＜0.01）。除人參組外，給藥各組小鼠血清中的MDA含量都有所下降，其中復方雙參組和紅景天組與空白組相比動物數（只）（P＜0.01），而復方雙參組和紅景天組之間的差異無統計學意義（P＞0.05）。與空白組相比，給藥各組中小鼠血清的LDH含量均有所增加，其中復方雙參組和紅景天組與空白組相比小鼠血清的LDH含量有顯著提高（P＜0.01），而復方雙參組和紅景天組之間的差異無統計學意義（P＞0.05）。結果見表5。

表4 復方雙參合劑對減壓缺氧小鼠心臟中生化指標的影響（±s）

表4 復方雙參合劑對減壓缺氧小鼠心臟中生化指標的影響（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與紅景天組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；“-”代表無數據；SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛

空白組（陰性對照）丹參組人參組復方雙參組紅景天組（陽性對照）10 10 10 10 10-0.2 g/kg 0.1 g/kg 0.1 g∶0.2 g/kg 0.6 g/kg組別 動物數（只） 劑量138.55±8.22 120.83±9.50△△174.55±24.35*205.46±21.99**198.87±28.87**4.18±0.67 4.36±0.52△3.16±0.47**1.31±0.84**△△3.55±0.64*SOD（U/mL） MDA（nmol/mL）

3 討論

丹參和人參在我國已有上千年的藥用歷史，人參具有“大補元氣、復脈固脫、補脾益肺、生津安神”之功能。有報道，人參的活性成分人參皂苷對心肌及腦缺血再灌注損傷有很好的保護作用[5]。丹參水提取物中的丹酚酸類成分具有很強的抗脂質過氧化作用，對脂質過氧化引起的細胞膜損傷有明顯的保護作用，可以減少自由基對心肌組織和腦組織造成的損傷[6]。本實驗將丹參水提取物和人參總皂苷經過組方制備成復方雙參合劑，考察其在常壓密閉缺氧及減壓缺氧條件下對小鼠的影響，實驗結果表明，復方雙參合劑可以顯著延長常壓密閉缺氧環境下小鼠的存活時間（P＜0.01），比空白組延長了45.95%，但與單方和紅景天相比無明顯優勢。干濕質量法測定腦組織含水量是評價腦損傷的一種簡單、準確、行之有效的方法[7]，本實驗將各組小鼠暴露在相當于海拔7000 m高度的低壓艙中7 h，結果表明復方雙參合劑可以顯著降低小鼠減壓缺氧環境下腦含水量，說明其可以緩解小鼠急性缺氧引成的腦水腫，對急性缺氧引成的腦損傷有一定的保護作用。為了進一步了解復方雙參合劑對小鼠抗缺氧能力的影響，本實驗設計測定了在急性減壓缺氧狀態下小鼠腦、心臟和血液中SOD、MDA以及LDH的水平，這些生化指標可以反映機體抗急性缺氧能力。SOD是機體重要的抗氧化酶，可有效清除OH、O2-、H2O2等多種自由基，減輕缺血、缺氧時脂質過氧化的損傷。膜脂質過氧化是細胞功能障礙和死亡的原因之一，MDA是脂質過氧化產物，其含量增高，表示更多的細胞功能遭到破壞。當人體由低海拔進入高海拔（3000 m以上）時，機體發生一系列氧自由基代謝改變，主要包括SOD降低與MDA升高，這種由低氧環境引起的抗氧化能力降低及脂質過氧化反應增強即為氧化脅迫，這可能與許多高原疾病的發生有關[8]。機體進入氧化脅迫狀態，腦部和心臟由于代謝紊亂，造成功能障礙，產生損傷。復方雙參合劑可以顯著提高急性減壓缺氧小鼠心臟和血清中SOD水平，并顯著降低MDA水平；復方雙參合劑對急性減壓缺氧小鼠腦部SOD水平無顯著影響，但可以顯著降低腦部MDA水平。實驗結果表明小鼠經低氧暴露后腦內和心臟內的脂質過氧化物含量明顯增加，復方雙參合劑可以顯著降低細胞膜脂質過氧化程度，說明復方雙參合劑通過抵抗氧自由基與脂質過氧化作用來保護急性減壓缺氧對腦細胞和心臟細胞的損傷。各給藥組沒有提高小鼠腦部LDH水平，并且復方雙參組和紅景天組還顯著低于空白組。近年來研究者們開始認識到成年動物腦可以利用乳酸作為能量底物，成年動物腦不僅可氧化利用血源性乳酸，并且星形膠質細胞能夠將從血液中攝取的葡萄糖轉變為乳酸提供給神經元作為能源物質，乳酸在腦星形膠質細胞和神經元的能量信息交流以及腦功能活動和能量代謝的偶聯中發揮著重要作用[9]，可能在急性缺氧的條件下，由于能量代謝障礙，腦部為了獲得足夠的能量，需要一定量的乳酸作為能量底物，造成此時LDH水平較低。復方雙參合劑可以顯著提高急性減壓缺氧小鼠血清中的LDH水平，表明復方雙參合劑可以減少血中乳酸的堆積，可能有利于機體減輕運動疲勞，有助于提高機體在低氧環境下的活動能力。本實驗采用的陽性對照紅景天膠囊，是由西藏大花紅景天精致而成，是療效確切的抗缺氧藥物[10]。但是西藏大花紅景天是一種珍貴、稀有的藥用植物，價格昂貴，而丹參和人參資源豐富，價格低廉，在本實驗中復方雙參合劑顯示出了良好的抗缺氧作用，可以通過進一步研究，開發出適合高原缺氧的有效藥物制劑。

表5 復方雙參合劑對減壓缺氧小鼠血清中生化指標的影響（±s）

表5 復方雙參合劑對減壓缺氧小鼠血清中生化指標的影響（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與紅景天組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；“-”代表無數據；SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛；LDH：乳酸脫氫酶

空白組（陰性對照）丹參組人參組復方雙參組紅景天組（陽性對照）10 10 10 10 10 25 mL/kg 0.2 g/kg 0.1 g/kg 0.1 g∶0.2 g/kg 0.6 g/kg組別 動物數（只） 劑量18.68±10.63 21.01±8.03△△40.97±8.77**△98.33±20.18**△△54.13±13.47**SOD（U/mL）1.00±0.19 0.94±0.24△△1.13±0.27△△0.23±0.10**0.15±0.06**1.98±0.56 2.16±0.58△△2.24±0.41△△5.27±0.91**4.80±0.96**MDA（nmol/mL） LDH（IU/L）

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