半胱天冬蛋白酶8基因多態性與先天性心臟病易感性的關聯研究

聶 宇 劉 銳 顧海勇 何 鋒 張 輝 劉瑞平 張 浩

1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 國家心血管病中心 阜外心血管病醫院 心血管疾病國家重點實驗室，北京 100037；2.南京醫科大學附屬常州市第二人民醫院中心實驗室，江蘇常州 213003

在胚胎正常發育過程中，細胞凋亡對生長和發育的調控發揮了重要作用；凋亡異常是導致胚胎異常發育的重要因素之一[1]。半胱天冬蛋白酶8（Caspase8）是一種細胞凋亡半胱天冬蛋白酶前體；Caspase8基因敲除小鼠會導致心肌缺陷并在胚胎期死亡，提示該蛋白酶與心臟發育密切相關[2]。現已發現，編碼人類半胱天冬蛋白酶的基因Caspase8存在功能性多態性位點rs3769818 C＞T，并與多類疾病的易感性相關[3]，但尚未有針對Caspase8 rs3769818 C＞T基因多態性與先心病易感性的相關研究。

先天性心臟病是新生兒致病和死亡的主要原因之一，在新生兒中的發病率約為1%[4-7]。多數先心病是遺傳與環境交互作用的結果；目前，已經有大量研究人員開始關注不同遺傳背景個體在先性心病易感性方面的差異，其中單核苷酸多態性（SNP）是個體遺傳差異的一個重要因素。鑒于Caspase8在心臟發育過程中的關鍵作用，探索先心病患兒中Caspase8 rs3769818 C＞T攜帶情況，對于理解先心病發病機制有重要意義。本研究對大動脈轉位（transpositionof the great arteries，TGA）和法洛四聯征（tetralogy of Fallot，TOF）兩類圓錐動脈干畸形先心病患兒，以及正常對照人群利用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）技術對Caspase8 rs3769818 C＞T基因型和等位基因差異進行了比較分析，進而探討Caspase8基因與先天性心臟病發生的相關性。

表1 三組一般資料比較

1 資料與方法

1.1 一般資料

對照組136例，為2009年12月～2011年7月在鎮江市第一人民醫院和常州市第二人民醫院的非先天性疾病患者。病例組244例（其中TOF組120例，TGA組124例），為同一時期在中國醫學科學院阜外心血管病醫院收集。所有對象均為漢族人群，病例組與對照組年齡、性別差異均統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究所涉內容已通過醫院倫理委員會評審，在樣本采集過程中所有研究對象均由法定監護人代理簽署知情同意書，研究對象及其法定監護人對研究知情同意。TOF組平均年齡（1.55±0.70）歲，TGA組平均年齡（2.27±0.49）歲，對照組平均年齡（1.58±0.61）歲；TGA組中30.6%為女性，TOF組中38.3%為女性，對照組中38.2%為女性。統計分析結果顯示年齡性別匹配較好。見表1。

1.2 實驗方法

獲取知情同意后，進行問卷調查調查相關背景資料。受試人群空腹采集2 mL（EDTA抗凝），1 h內4000 r/min離心10 min，分離白細胞。運用Qiagen DNA提取試劑盒提取白細胞DNA，進行分裝低溫凍存。運用美國Sequenom公司的MassARRAYTM Analyzer技術平臺進行SNP分型，具體步驟見參考文獻[8]。結果由MassARRAYRT軟件系統實時讀取，MassARRAY Typer 4.0軟件完成基因分型分析。為驗證檢測的準確度，10%的樣本接受重復檢測。

1.3 統計學方法

統計學處理應用SPSS 13.0統計軟件包完成。病例組與對照組的基本特征進行χ2檢驗和（或）t檢驗；采用單因素Logistic回歸分析計算優勢比（odds ratio，OR）及其95%置信區間（confidence interval，CI）（表示 Caspase8 rs3769818 C＞T多態性位點變異型與野生型純合型比較，導致先心病發生的相對風險度）。

2 結果

2.1 遺傳平衡檢驗

將對照人群Caspase8 rs3769818 C＞T位點的基因型進行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，結果提示P值符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律 （P=0.951）， 說明該人群Caspase8 rs3769818 C＞T位點基因型頻率處于平衡狀態，具有群體代表性。

2.2 SNP位點質譜分型

基于MALDI-TOF的質譜分型結果顯示，對Caspase8 rs3769818 C＞T等位基因的分型結果良好可信，TOF組，TGA組和對照組CC基因型共193例，CT基因型共146例，TT基因型共36例，分型失敗共5例，分型成功率達到98.68%（圖1），能夠用于進一步的相關性分析。

圖1 Caspase8 rs3769818 C＞T多態性位點質譜（MALDI-TOF MS）分型圖

2.3 Caspase8 rs3769818 C＞T位點基因型分布與先心病易感性關系

在單個位點的分析中，筆者發現TOF及TGA病例和對照中Caspase8 rs3769818 C＞T位點發生頻率差異不明顯。Logistic回歸分析結果發現，與攜帶Caspase8 rs3769818 CC基因型的個體相比較，Caspase8 rs3769818 CT基因型攜帶者與先心病（TGA和TOF）的發病風險不存在明確相關性 （TOF OR=0.99，95%CI=0.59～1.67；P=0.974）和（TGA OR=0.99，95%CI=0.59～1.67；P=0.974）（表2）；攜帶Caspase8 rs3769818 TT基因型與TOF及TGA的發病風險無明顯相關（TOF OR=1.17，95%CI=0.45～2.98；P=0.751）和（TGA OR=1.86，95%CI=0.79～4.41；P=0.157）（表2）。在顯性模型和隱性模型中，Caspase8 rs3769818 C＞T各基因型與TOF及TGA的發病風險無明顯相關（表2）。

表2 Caspase8 rs3769818 C＞T多態性和先天性心臟病危險關系的Logistic回歸分析

3 討論

Caspase8多態性與腫瘤等多種疾病易感性相關[9-12]，但對Caspase8多態性與先天性心臟病易感性的研究尚無報道。本文以兩種圓錐動脈干畸形先心病（TGA和TOF）為對象，研究了Caspase8 rs3769818 C＞T多態性位點與中國人群先天性心臟病發生風險之間的相關性。通過基質輔助激光解析電離飛行時間質譜分型及統計學分析，本研究發現Caspase8 rs3769818 C＞T多態性與先天性心臟病TGA和TOF的發病危險性無明確關聯。研究結果顯示Caspase8 rs3769818 C＞T最小等位基因型頻率（minor allele frequency，MAF）為0.274，該頻率與Hapmap數據庫中提供的亞洲人群相應位點的基因型分布無明顯差異（T：0.300），同時對照基因型符合Hardy-Weinberg遺傳平衡（P=0.951）；說明對照人群選擇具有代表性。

需要指出的是，盡管本研究結果提示Caspase8 rs3769818 C＞T與先心病發生風險無明確相關性，但本研究樣本量不大，并且是以醫院為基礎的病例對照研究，不能完全排除選擇偏倚。另一方面，先心病的發生也可能與母親基因型的關系更大，但本研究沒有涉及母親Caspase8 rs3769818 C＞T多態性與子代先心病易感性的關系，也缺乏凋亡相關其他基因以及基因-基因相互作用的研究。未來，我們需要在不同人群中進行大樣本的研究再加以功能學驗證方可能獲得更為明確的答案。

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