外周血miR-29a-3p、miR-365a-3p在活動性肺結核和結核潛伏感染者中的表達

劉守江 張 帆 魏 巍 覃林珍 閆 敬 王三清 王 健

廣東省深圳市南山區慢性病防治中心結核病防治科，廣東深圳 518054

微小 RNA（microRNA，miRNA）是一類廣泛存在于真核細胞中，長度約20 nt的高度保守的非編碼RNA調控因子，是由全長的mRNA樣轉錄子加工而來，通過與對應的靶mRNA的3'非翻譯區的非完全或完全配對結合，阻止其翻譯或破壞其穩定性，實現對基因表達的調控，越來越多的研究表明，miRNA在腫瘤、糖尿病、心血管疾病、病毒感染等多種疾病中都起著重要作用，是正常和疾病狀態下基因調節的一個新的機制[1-2]。近年miRNA在肺結核患者中表達也是研究熱點之一。本研究主要探討miR-29a-3p、miR-365a-3p分子在活動性肺結核（TB）和結核潛伏感染（LTBI）者外周血中的表達情況。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集深圳市南山區慢性病防治院（以下簡稱“我院”）結核病防治科門診2012年1～10月診治的TB患者30例，其中男 17例，女 13例，平均年齡（26.1±10.1）歲，診斷標準：經痰抗酸桿菌涂片陽性，臨床癥狀結合X線表現、CT診斷以及病原學檢查，符合全國結核病分類與診斷標準；LTBI者 30例，其中男 14例，女16例，平均年齡（28.9±9.5）歲，判定標準：采用結核菌特異性酶聯免疫斑點試驗陽性，而胸片未見異常[3]。兩組研究對象之間的年齡、性別比較差異無統計學意義 （P＞0.05）。所有研究對象均排除HBV、HCV、HIV病毒感染及其他慢性疾病如高血壓、糖尿病、腎炎、自身免疫性疾病等。所有研究對象均經我院倫理委員會批準通過，并簽署知情同意書。

1.2 標本的收集和處理

抽取外周靜脈血2 mL，30 min內分裝200 μL全血于凍存管中（已預裝有Trizol和研磨珠），振蕩混勻后-80℃保存；根據Trizol Reagent試劑盒說明書（Invitrogen）抽提總RNA，核酸測定儀測定濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳分析RNA的完整性；-80℃保存。

1.3 研究方法

1.3.1 全血RNA提取 加入1 mL Trizol，充分裂解細胞，加入 200 μL 氯仿，劇烈振蕩 15 s，室溫放置 3 min，12 000 r/min，4℃，離心15 min。吸取上層水相，至另一離心管中。加入1.5倍體積異丙醇充分混勻，室溫放置10 min。12 000 r/min，4℃，離心10 min，RNA沉淀于管底，傾倒上清，沉淀物用75%乙醇洗滌2次，室溫晾干10 min，加入適量無RNase水充分溶解，調整RNA濃度。

1.3.2 反轉錄-熒光定量PCR檢測 miRNA反轉錄反應體系為 20 μL，0.5 g/L 總 RNA 1 μL，2×反轉錄緩沖混合物 10 μL，RNase Free 水 5 μL，反轉錄酶 2 μL，0.1%BSA 2 μL。反轉錄反應條件為 37℃ 60 min，85℃ 5 min，4℃ 5 min。熒光定量 PCR 反應體系為 25 μL，cDNA 模板 2 μL， 水 8.5 μL，SYBR Green 12.5 μL，上游引物 1 μL，下游引物 1 μL。熒光定量PCR反應條件為預變性95℃10 s；變性和延伸95℃5 s；60℃ 20 s，共40個循環。引物采用在線設計軟件：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/；管家基因U6為內參照，測得的數據用平均相對含量表示。引物由invitrogen合成，引物序列見表1。

表1 反轉錄-熒光定量PCR引物序列（5'-3'）

1.4 統計學方法

采用SPSS 13.0統計軟件進行數據分析，比較兩組間差異采用t檢驗，相關性分析采用Pearson檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 外周血miR-29a-3p在活動性肺結核和結核潛伏感染者中的表達

對活動性肺結核患者和LTBI外周血miR-29a-3p數據進行分析，結果表明，外周血miR-29a-3p表達在LTBI（1.16±0.65）中明顯高于活動性肺結核患者組（0.71±0.32）（P＜0.05）。見圖1。

2.2 外周血miR-365a-3p在活動性肺結核和結核潛伏感染者中的表達

對活動性肺結核患者和LTBI外周血miR-365a-3p數據進行分析，結果表明，活動性肺結核組外周血miR-365a-3p 表達（0.32±0.71）與 LTBI（0.43±0.51）比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2。

2.3 結核潛伏感染者外周血miR-29a-3p表達與結核菌特異性酶聯免疫斑點數相關性分析

相關性分析發現，LTBI外周血miR-29a-3p表達與結核菌特異性酶聯免疫斑點數呈負相關 （r=-0.42，P=0.02）。見圖3。

3 討論

miRNA在細胞生長發育、分化、增殖、凋亡、腫瘤發生等發生發展中均起到重要作用。越來越多的研究發現miRNAs表達失調與多種疾病發生（如病毒感染、心血管疾病、肺部疾病、纖維化、腫瘤等）密切相關。近年來研究也發現miRNA可以參與調節免疫細胞的成熟、增殖、分化和活化，miRNA通過選擇性表達，干擾、降解或抑制靶基因的mRNA，從而調控免疫反應，其在固有免疫應答和適應性免疫應答中均起到重要作用，如通過下調信號通路TCR中多種蛋白磷酸激酶活性，調節TCR信號通路強度[4]；通過下調促凋亡蛋白和腫瘤抑制因子，促進T細胞、B細胞增殖；通過下調SOCS1信號通路調節Treg細胞發育[5]、通過下調AID調節B細胞抗體類別轉換[6-7]，以及通過下調多種轉錄因子調節髓樣細胞的增殖和分化等多種形式。

microRNA-29a（miR-29a）是新近發現的一個與多種疾病發生緊密相關的小分子RNA家族，除3'端非編碼區堿基區域（3'untranslated region，3'UTR）外，miR-29 也可與非3'UTR區內的miRNA調節元件（miRNA regulator elments，MRE）結合發揮作用。彈性蛋白3'UTR和編碼區共有14個miR-29的結合位點，熒光素酶報告基因分析方法證實：miR-29可通過同時與編碼區內和3'UTR的MRE結合來抑制彈性蛋白表達，編碼區內的MRE在miR-29抑制彈性蛋白的表達中起到了協同作用。研究發現miR-29靶基因主要的是細胞外基質及遷移蛋白[8-9]，miR-29可直接抑制多種膠原蛋白表達。而膠原蛋白異常聚集可導致纖維化，因此miR-29在抗纖維化中起到重要作用。目前研究也發現miR-29a在機體免疫反應中也起到重要作用，miR-29a靶基因相關蛋白參與多個信號通路。miR-29a可通過抑制這些信號蛋白表達參與多條信號通路的調控。其中miR-29a是經典Wnt通路中信號分子——T細胞因子（T-cellfactor，TCF）或淋巴樣增強因子（lymphoi denhancer factor，LEF）的負調控分子，miR-29a可通過靶向降解IFN-γ降低機體對胞內病原體的免疫應答[10-11]。本研究也發現LTBI外周血miR-29a-3p表達明顯高于活動性肺結核患者組，LTBI外周血miR-29a-3p表達與結核菌特異性酶聯免疫斑點數呈負相關，miR-29a-3p表達高的，結核菌特異性酶聯免疫斑點數卻較少，而結核菌特異性酶聯免疫斑點數反應了T細胞分泌IFN-γ的能力，因此miR-29a-3p在肺結核感染、發病過程中可能起到重要作用。

IL-6是介導組織炎癥的重要細胞因子，趨化、活化中性粒細胞和單核細胞，促進炎癥遞質釋放，增強局部炎性反應。研究發現miR-365a可負性調節IL-6表達，抑制IL-6蛋白生成，miR-365通過與IL-6基因的3'UTR的MRE結合，直接抑制IL-6 mRNA表達，除此之外，miR-365也可能通過非直接途徑抑制IL-6表達，體外實驗發現miR-365調節IL-6的能力超過let-7a[12]，因此miR-365a在炎性反應中也起到重要作用，但本研究中并未發現結核潛伏感染者和活動性肺結核之間差異，miR-365a-3p在肺結核發病中的作用還需進一步研究。

綜上所述，miRNA-29a表達在肺結核感染、發病過程中可能起到重要作用。隨著研究的不斷深入，miRNA-29a將在肺結核診斷及致病機制中作用更加清楚、明確，且有可能成為區別結核潛伏感染者的一個重要標志分子。

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