孔圣枕中丹對自發(fā)性高血壓大鼠前額葉皮質(zhì)及紋狀體TH、DAT、DRD1、DRD2蛋白和基因表達(dá)的影響

陳曉剛 譚麗麗 賴東蘭 許雙虹 李宜瑞

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，廣東廣州 510405；2.廣州市第八人民醫(yī)院兒科，廣東廣州 510060

注意缺陷多動(dòng)障礙（attentiondeficithyperactivitydisorder，ADHD），是以注意力不集中、多動(dòng)、沖動(dòng)等為主要表現(xiàn)的常見兒童行為障礙，嚴(yán)重危害兒童的身心健康。以哌甲酯為代表的中樞興奮劑雖是目前治療ADHD的首選，但也存在不良反應(yīng)較多、管理困難等諸多問題[1]。大量臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥治療ADHD具備獨(dú)特優(yōu)勢[2-3]。本研究檢測了孔圣枕中丹煎劑對ADHD動(dòng)物模型——自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneous hypertensive rat，SHR）前額葉皮質(zhì)及紋狀體（含伏核）中的酪氨酸羥化酶（TH）、多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體（DAT）、多巴胺D1受體（DRD1）、多巴胺D2受體（DRD2）的基因和蛋白表達(dá)的影響，并與鹽酸哌甲酯對照，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級雄性8周齡的SHR大鼠36只，體重240～300 g，由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所生產(chǎn)供應(yīng)部提供[許可證號：SCXK（111）2008-16]。

1.2 主要儀器與試劑

DAB顯色試劑盒，SA1022兔IgG試劑盒，鼠IgG試劑盒，大鼠IgG試劑盒，原位雜交試劑盒（博士德生物技術(shù)有限公司）；TH 抗體：兔抗（Miliproe抗體公司）；DAT 抗體：大鼠抗體（abcam抗體公司）；DRD1抗體：兔抗（abcam抗體公司）；DRD2抗體：小鼠抗體（Santa抗體公司）。顯微鏡（日本OLYMPUS公司CHK2-F-GS型），離心機(jī)（上海安亭TGL-16G型），電熱恒溫水箱（廣州東方Y(jié)H140-1型）。

1.3 孔圣枕中丹煎劑的制備

孔圣枕中丹方由龍骨、龜板、遠(yuǎn)志、石菖蒲4味中藥組成（比例 4∶2∶1∶2），廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診部藥房提供生藥，制成水煎劑，并配成含生藥約1.154 g/mL的溶液，充分?jǐn)噭颍A于4℃冰箱備用。鹽酸哌甲酯（蘇州醫(yī)藥集團(tuán)有限公司）終濃度為0.24 g/L。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

圖1 免疫組化法檢測三組自發(fā)性高血壓大鼠前額葉皮質(zhì)TH、DAT、DRD1、DRD2 的表達(dá)（ABC 法，200×）

所有大鼠隨機(jī)分為三組（孔圣枕中丹組、鹽酸哌甲酯組及生理鹽水對照組），每組12只（其中6只用于免疫組化實(shí)驗(yàn)，6只用于原位雜交實(shí)驗(yàn)）。稱重，編號，用灌胃針分別對三組大鼠進(jìn)行灌胃，其中，孔圣枕中丹灌藥量：7.2 g/kg；鹽酸哌甲酯灌藥量：1.5 mg/kg（均稀釋為25 mL/kg后灌服），生理鹽水對照組灌服生理鹽水25 mL/kg。灌藥28 d后稱重，進(jìn)行相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)處理。

1.5 取材

各組大鼠在實(shí)驗(yàn)第29天上午8∶00取材。以3.5%濃度的水合氯醛，麻醉處理大鼠；開胸暴露心臟，左心室心尖插入灌注針頭，剪開右心耳，生理鹽水快速灌注后，換4%多聚甲醛的PBS緩沖液緩慢灌注固定；取相應(yīng)腦組織并放于4%多聚甲醛溶液中固定，30%蔗糖溶液脫水；冰凍切片機(jī)切片后，置于-20℃冰箱備用。

1.6 免疫組織化學(xué)法

選擇冰凍切片，每組各6張，主要步驟如下：滅活內(nèi)源性酶，滴加5%BSA封閉液，分別滴加一抗（250倍稀釋的DRD1，50倍稀釋DRD2，50倍稀釋 DAT以及 500倍稀釋TH抗體），37℃水浴箱孵育1 h后，滴加生物素化二抗，孵育 20 min，SABC，37℃水浴箱放置 20 min，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，二甲苯透明，封片。光鏡下觀察結(jié)果并拍片。免疫組化結(jié)果以單個(gè)視野下平均光密度IOD（X）表示。

圖2 免疫組化法檢測三組自發(fā)性高血壓大鼠紋狀體TH、DAT、DRD1、DRD2 的表達(dá)（ABC 法，200×）

表1 免疫組化法檢測三組自發(fā)性高血壓大鼠前額葉皮質(zhì)TH、DAT、DRD1、DRD2 的表達(dá)（±s，n=6）

表1 免疫組化法檢測三組自發(fā)性高血壓大鼠前額葉皮質(zhì)TH、DAT、DRD1、DRD2 的表達(dá)（±s，n=6）

注：與生理鹽水對照組比較，*P＜0.05；與鹽酸哌甲酯組比較，#P＜0.05；TH：酪氨酸羥化酶；DAT：多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體；DRD1：多巴胺D1受體；DRD2：多巴胺D2受體

孔圣枕中丹組鹽酸哌甲酯組生理鹽水對照組10.10±3.25*#7.78±2.73*4.79±2.53 9.06±1.81*#14.20±1.19*17.57±3.74組別 TH DAT 14.67±1.49*11.45±1.42*18.06±2.20 DRD1 14.83±1.84*11.01±1.03*17.83±3.36 DRD2

表2 免疫組化法檢測三組自發(fā)性高血壓大鼠紋狀體TH、DAT、DRD1、DRD2 的表達(dá)（±s，n=6）

表2 免疫組化法檢測三組自發(fā)性高血壓大鼠紋狀體TH、DAT、DRD1、DRD2 的表達(dá)（±s，n=6）

注：與生理鹽水對照組比較，*P＜0.05；與鹽酸哌甲酯組比較，#P＜0.05；TH：酪氨酸羥化酶；DAT：多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體；DRD1：多巴胺D1受體；DRD2：多巴胺D2受體

孔圣枕中丹組鹽酸哌甲酯組生理鹽水對照組14.30±3.85*#9.36±2.59*6.30±3.21 9.78±1.24*#14.30±2.43*17.79±2.39組別 TH DAT 14.24±2.19*11.22±2.78*22.10±2.90 DRD1 11.05±1.39*13.83±1.20*16.64±0.72 DRD2

圖3 原位雜交法檢測3組自發(fā)性高血壓大鼠前額葉皮質(zhì)TH、DAT、DRD1、DRD2 的表達(dá)（ABC 法，×200）

1.7 原位雜交法

選擇冰凍切片，每組各6張，主要步驟如下：30%H2O2和純甲醇混合液（1︰50，含 0.1%DEPC），室溫固定 30 min；胃蛋白酶消化，暴露mRNA核酸片段，后固定，預(yù)雜交，雜交，雜交后洗滌，滴加封閉液，滴加生物素化鼠抗地高辛標(biāo)記，SABC，DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染、飽和，酒精脫水，二甲苯透明，封片。光鏡下觀察結(jié)果并拍片。原位雜交結(jié)果以單個(gè)視野下平均光密度IOD（X）表示。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SSPS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化法檢測結(jié)果

免疫組化法檢測三組SHR大鼠前額葉皮質(zhì)及紋狀體TH、DAT、DRD1、DRD2 的表達(dá)（圖1、2），采用 Imaga-Pro-Plus 6.0軟件分析，結(jié)果以單個(gè)視野下平均光密度IOD（X）來表示（表1、2）。

圖4 原位雜交法檢測3組自發(fā)性高血壓大鼠紋狀體TH、DAT、DRD1、DRD2 的表達(dá)（ABC 法，×200）

結(jié)果表明：在SHR大鼠的前額葉皮質(zhì)及紋狀體，TH的蛋白表達(dá)，孔圣枕中丹組高于鹽酸哌甲酯組，鹽酸哌甲酯組又高于生理鹽水對照組；DAT的蛋白表達(dá)，孔圣枕中丹組低于鹽酸哌甲酯組，鹽酸哌甲酯組又低于生理鹽水對照組；DRD1和DRD2的蛋白表達(dá)，孔圣枕中丹組和鹽酸哌甲酯組均低于生理鹽水對照組。

2.2 原位雜交法檢測結(jié)果

原位雜交法檢測三組SHR大鼠前額葉皮質(zhì)及紋狀體TH、DAT、DRD1、DRD2 的表達(dá)（圖3、4），采用 Imaga-Pro-Plus 6.0軟件分析，結(jié)果以單個(gè)視野下平均光密度IOD（X）來表示（表3、4）。

與免疫組化實(shí)驗(yàn)相似：在SHR大鼠的前額葉皮質(zhì)及紋狀體，TH的基因表達(dá)，孔圣枕中丹組高于鹽酸哌甲酯組，鹽酸哌甲酯組又高于生理鹽水對照組；DAT的基因表達(dá)，孔圣枕中丹組低于鹽酸哌甲酯組，鹽酸哌甲酯組又低于生理鹽水對照組；DRD1和DRD2的基因表達(dá)，孔圣枕中丹組和鹽酸哌甲酯組均低于生理鹽水對照組。

表3 原位雜交法檢測三組自發(fā)性高血壓大鼠前額葉皮質(zhì)TH、DAT、DRD1、DRD2 的表達(dá)（±s，n=6）

表3 原位雜交法檢測三組自發(fā)性高血壓大鼠前額葉皮質(zhì)TH、DAT、DRD1、DRD2 的表達(dá)（±s，n=6）

注：與生理鹽水對照組比較，*P＜0.05；與鹽酸哌甲酯組比較，#P＜0.05；TH：酪氨酸羥化酶；DAT：多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體；DRD1：多巴胺D1受體；DRD2：多巴胺D2受體

孔圣枕中丹組鹽酸哌甲酯組生理鹽水對照組23.00±2.10*#19.26±1.26*16.63±3.09 9.32±1.40*#16.45±3.23*26.28±4.48組別 TH DAT 22.54±2.69*16.47±1.25*38.65±1.10 DRD1 14.68±1.03*11.18±1.01*17.44±2.84 DRD2

表4 原位雜交法檢測3組自發(fā)性高血壓大鼠紋狀體TH、DAT、DRD1、DRD2 的表達(dá)（±s，n=6）

表4 原位雜交法檢測3組自發(fā)性高血壓大鼠紋狀體TH、DAT、DRD1、DRD2 的表達(dá)（±s，n=6）

注：與生理鹽水對照組比較，*P＜0.05；與鹽酸哌甲酯組比較，#P＜0.05；TH：酪氨酸羥化酶；DAT：多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體；DRD1：多巴胺D1受體；DRD2：多巴胺D2受體

孔圣枕中丹組鹽酸哌甲酯組生理鹽水對照組22.92±1.87*#19.24±0.77*16.47±1.19 11.75±1.99*#17.72±2.77*30.54±9.08組別 TH DAT 17.29±1.27*14.02±1.55*23.12±2.70 DRD1 9.68±1.65*12.70±0.70*17.15±1.05 DRD2

3 討論

迄今為止，腦內(nèi)多巴胺（DA）功能缺陷是注意缺陷多動(dòng)障礙（ADHD）發(fā)病機(jī)制中最有力假說[4]，其中DA對前額葉皮質(zhì)-紋狀體環(huán)路的調(diào)控尤為重要，這已得到分子遺傳學(xué)和功能腦成像技術(shù)等研究結(jié)果的證實(shí)[5-6]；神經(jīng)藥理的研究也發(fā)現(xiàn)，中樞興奮劑能阻滯突觸前膜上DAT對DA的重?cái)z取作用，從而提高突觸間隙中的DA濃度，并可能促進(jìn)突觸前的DA釋放[7]。

自20世紀(jì)80年代以來，國內(nèi)中醫(yī)藥界的學(xué)者開始應(yīng)用中醫(yī)藥治療ADHD。多家報(bào)道都肯定了中醫(yī)藥治療ADHD的功效。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為ADHD的病機(jī)特點(diǎn)是陽動(dòng)有余而陰靜不足，其中腎陰不足，肝陽偏旺為本病最常見證型[8]。既往的文獻(xiàn)研究結(jié)果提示，由唐代著名醫(yī)家孫思邈所創(chuàng)制的孔圣枕中丹是治療ADHD的基本方劑之一，該方由龜板、龍骨、石菖蒲、遠(yuǎn)志四味藥組成，方中龜板、龍骨補(bǔ)腎鎮(zhèn)肝、潛陽安神，遠(yuǎn)志交通心腎、強(qiáng)志聰明，石菖蒲散肝舒脾、開竅寧神，諸藥合用，腎陰既補(bǔ)，肝陽得潛，心神安寧，陰陽平和。各地學(xué)者的臨床研究都充分肯定了其療效[9]。

本項(xiàng)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在灌服孔圣枕中丹煎液后，SHR大鼠前額葉皮質(zhì)和紋狀體（含伏核）中DAT的蛋白表達(dá)和基因表達(dá)均降低，說明孔圣枕中丹下調(diào)了腦內(nèi)DAT的表達(dá)，這可能意味著減少了突觸前膜對DA的重?cái)z取作用，從而增加突觸間隙中的DA濃度。另一方面，SHR大鼠在灌服孔圣枕中丹煎液后，其前額葉皮質(zhì)和紋狀體（含伏核）中的TH蛋白和基因表達(dá)上調(diào)，鑒于TH是合成包括DA在內(nèi)的兒茶酚胺（CA）的限速酶，提示孔圣枕中丹可能也促進(jìn)了腦內(nèi)的DA合成。這些都有利于改善腦內(nèi)DA的信號傳導(dǎo)。

研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，孔圣枕中丹下調(diào)了SHR大鼠前額葉皮質(zhì)和紋狀體中DRD1的蛋白和基因表達(dá)。既往研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)大鼠在前額葉皮質(zhì)定位注入DA的D1受體激動(dòng)劑Bromocriptine后，其注意缺陷得到顯著改善；相反，注入D1受體拮抗藥SCH23390則出現(xiàn)障礙[10]。有趣的是，激動(dòng)DRD1改善注意缺陷的效應(yīng)呈倒“U”型，提示只有適宜水平的刺激效應(yīng)最大，過高或過低反而加重注意缺陷；哌甲酯被發(fā)現(xiàn)能下調(diào)突觸后DRD1水平，使DA對DRD1的刺激處于合適水平[11]。所以，筆者推測，孔圣枕中丹下調(diào)DRD1可能主要是其提高了突觸間隙DA含量后的負(fù)反饋?zhàn)饔媒Y(jié)果。此外，SHR大鼠在灌服孔圣枕中丹煎液后，前額葉皮質(zhì)和紋狀體中DRD2含量也下降。迄今為止，DRD2在ADHD發(fā)病中的作用尚不清楚，但有分子遺傳學(xué)上的研究結(jié)果提示其與ADHD的相關(guān)性[12]。不過本研究初步認(rèn)為，孔圣枕中丹下調(diào)DRD2的作用可能與對DRD1的作用類似，也是提高突觸間隙DA含量的負(fù)反饋調(diào)節(jié)所致，這需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

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