原發性肝癌高表達抗原GPC-3的HLA-A2限制性細胞毒性T淋巴細胞表位預測

雷俊華，曾江正，郝新寶，蘇群豪，洪 濤，何志惠，黃 芬

目前資料表明，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3，GPC-3)不僅是診斷原發性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)特異性及敏感性較高的腫瘤標記物，而且作為一種分泌型癌蛋白，與HCC發生發展及預后密切相關，有可能作為細胞免疫治療的作用靶點［1-2］。表位是引起免疫應答和免疫反應的基本單位，確定特異性細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)的表位對于研究細胞免疫機制、過程以及研制多肽疫苗和基因疫苗等具有重要意義。在所有HLA基因型中，HLA-A2是在人群中最普遍表達的等位基因，因此由HLA-A2分子遞呈的腫瘤抗原肽表位誘導的CTL在腫瘤細胞免疫治療中具有重要意義［3］。表位預測的過程是根據不同環節聯合應用多種表位預測方法如BIMAS、SYFPEITHI等獲得候選表位。本研究采用超基序、量化基序法及NetCTL數據庫預測分析法對靶抗原GPC-3 HLA-A2限制性CTL表位進行預測，為針對GPC-3表位的細胞靶向免疫治療奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 資料 GPC-3基因組位于人染色體Xq26.1，全長大于900 kb。從國家生物技術信息中心(NCBI)網站獲取人GPC3蛋白的氨基酸全長序列580 aa，其編碼的蛋白質序列如下:magtvrtacl vvamllsldf pgqaqppppp pdatchqvrs ffqrlqpglk wvpetpvpgs dlqvclpkgp tccsrkmeek yqltarlnme qllqsasmelkfliiqnaav fqeafeivvr haknytnamf knnypsltpq afefvgefft dvslyilgsd invddmvnel fdslfpviyt qlmnpglpds aldineclrg arrdlkvfgn fpklimtqvs kslqvtrifl qalnlgievi nttdhlkfsk dcgrmltrmw ycsycqglmm vkpcggycnv vmqgcmagvv eidkywreyi lsleelvngm yriydmenvl lglfstihds iqyvqknagk ltttigklca hsqqrqyrsa yypedlfidk kvlkvahveh eetlssrrre liqklksfis fysalpgyic shspvaendt lcwngqelve rysqkaarng mknqfnlhel kmkgpepvvs qiidklkhin qllrtmsmpk grvldknlde egfesgdcgd dedeciggsg dgmikvknql rflaelaydl dvddapgnsq qatpkdneis tfhnlgnvhs plklltsmai svvcffflvh。

1.2 CTL表位的超基序法遠程預測 采用SYFPEITHI抗原肽預測軟件，掃描GPC-3抗原的氨基酸序列，對GPC-3的HLA-A2限制性CTL表位進行預測，預測由9個氨基酸殘基組成的CTL表位。利用 Intenet網絡進入 SYFPEITHI主頁，選擇“Epitope prediction”進入CTL表位預測界面，于 ＜Select MHC type＞復選框選定CTL表位限制性MHC類型為HLA-A*0201，表位肽大小選9肽，得出一系列候選表位，選擇得分大于20的表位進一步分析。

1.3 量化基序法預測 在BIMAS預測軟件序列輸入框中輸入GPC-3序列，＜HLA molecule＞選定HLA-A*0201，表位肽大小選9肽，輸出結果確切表位數選40，運行軟件，得出一系列候選表位。

1.4 NetCTL數據庫預測 進入NetCTL數據庫主頁，預測由9個氨基酸組成的CTL表位，在supertype中分別選擇A2 supertype，將Weight on C terminal cleavage，Weight on TAP transport efficiency 和Threshold for epitope identification依次賦值0.15，0.05和0.85。輸入GPC-3氨基酸序列后然后點擊Submit進行在線預測。預測出的數值中包括氨基酸序列位點(ID)、多肽序列(Sequence pep)、與HLA-Ⅰ分子的結合力(aff)、羧基端酶切效率(cle)、結合力重置值(aff rescale)、抗原處理相關轉運蛋白轉運效率(tap)、綜合分值(COMB)。其中將COMB值大于1.0的表位肽作為候選肽進一步分析。

2 結果

結合超基序法與量化基序法預測結果，選擇在兩種算法中均出現且總得分(SYFPEITHI與BIMAS得分相乘)較高的10條9肽(表1)。進一步采用NetCTL數據庫 CTL表位的整合預測方法，ID、Sequence pep、aff、aff rescale、cle、tap 及 COMB 見表 2。

3 討論

腫瘤疫苗是腫瘤免疫治療的重要方法，可以通過腫瘤細胞表面標志設計特異性的腫瘤疫苗，從而達到靶向殺傷腫瘤細胞的目的。已有研究證明，利用腫瘤疫苗有效激活特異性CTL，是實現腫瘤主動免疫治療的關鍵。目前常用的腫瘤疫苗傳遞方式分別以細胞、多肽、蛋白質、病毒載體為基礎。隨著對免疫應答分子機制的深入研究，研究者已逐漸意識到機體的免疫細胞并不是針對病原體或天然抗原的整體分子，而是針對各種抗原分子中的免疫活性部分即抗原決定簇或表位，蛋白質抗原是通過其表位而體現其特異性免疫。基于抗原分子的免疫干預手段已開始向表位水平過渡［4］。CTL表位作為抗腫瘤的新一代多肽疫苗，被認為是最有希望的腫瘤細胞免疫治療方式之一［5］。

表1 SYFPEITHI法、BIMAS法預測原發性肝癌高表達抗原GPC-3的HLA-A2限制性細胞毒性T淋巴細胞候選表位

表2 應用Net細胞毒性T淋巴細胞數據庫進行細胞毒性T淋巴細胞候選表位整合預測

GPC-3是一種膜性硫酸乙酰肝素糖蛋白，可通過結合細胞外基質、蛋白酶和生長因子等多種途徑參與調節腫瘤細胞的增殖、分化、黏附和轉移等［6-7］。肝細胞癌變時GPC-3表達異常，上調后激活整合素(integrin)、胰島素樣生長因子-Ⅱ(IGF-Ⅱ)和Wnt信號通路等促進肝癌細胞生長，影響多種信號傳導途徑，導致肝細胞的增殖、分化及癌變［8-9］。GPC-3是激活整合素信號通路的關鍵蛋白之一，通過此信號通路可促進肝細胞惡性轉化、肝癌細胞的增殖及侵襲轉移能力增強［10］。Ho 等［11］研究證實GPC-3在肝癌干細胞中高表達。與GPC-3全基因序列腺病毒相比，多肽疫苗沒有腺病毒載體的參與，不必考慮載體及其整合的安全性，也不必考慮全長蛋白中某些非優勢表位或病理表位的毒性反應，而且抗原肽長度僅8～15個氨基酸序列，體外可以合成，臨床應用前景更廣闊［12-14］。

基序是蛋白質一級結構中氨基酸排列順序，不少屬于同一HLA家族甚至不同家族的HLA同種異性分子接納的抗原肽為具有相同或相似的錨著殘基構成的肽基序，即超基序。根據MHC-I結合肽長度、殘基組成特征，可以有效進行MHC-I分子結合肽的預測。SYPHETH即是根據上述原理進行表位預測。量化基序法是應用統計學方法從大量實驗數據中得出每個位置每種殘基影響肽段與某種MHC-I類分子結合的系數表或統計矩陣，并采用這些數據進行在線預測的一類方法的統稱。其原理是:在抗原肽與HLA-A2分子的結合過程中，抗原肽的側鏈效應，主要依賴于相應的氨基酸殘基在肽中所處的位置，而受相鄰氨基酸殘基影響較小。BIMAS即是根據上述原理進行表位預測。以往CTL表位預測大多是基于BIMAS和SYFPEITHI數據庫，這些數據庫主要針對HLA多態性等位基因的篩選方法，并且只能預測候選表位與HLA亞型分子的結合力分值。而基于人工神經網絡方法的NetCTL 1.2Server數據庫整合了aff、cle、tap等，并且對這幾項分值進行綜合評分。本文結合超基序法與量化基序法預測結果，選擇在兩種算法中均出現且總得分較高的表位肽進一步采用NetCTL綜合評分，得到了10個分值相對較高的表位抗原肽。因此將兩種程序的預測結果再綜合NetCTL進行分析，實現兩類不同機制預測程序的有機結合，可以提高表位預測的準確率。本研究結果表明上述表位很可能為HLA-A2限制性CTL的優勢表位，這些表位經過進一步鑒定可作為腫瘤細胞靶向免疫治療的基礎。

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