CD55蛋白的表達在大鼠神經病理性疼痛發病機制中的作用

朱海娟，王金保

前期研究證實神經病理性疼痛大鼠脊髓背角發生補體異常激活，且此處高表達的補體蛋白在動物模型痛覺過敏的形成和發展中發揮重要作用［1-3］。為了探索CD55蛋白作為重要的補體調節蛋白，在神經病理性疼痛(NPP)的發病過程中是否發揮作用，本研究制作NPP大鼠慢性坐骨神經縮窄損傷模型(CCI)、保留性脊神經損傷模型(SNI)，測定大鼠脊髓中CD55蛋白表達情況，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 60只健康清潔級SD大鼠(河北醫科大學動物實驗中心提供，動物合格證號:冀醫動管字703058號)，雄性，體重200～250 g。隨機分為假手術組、CCI組、SNI組3組，每組20只。室溫(20±2)℃，嚴格12 h明暗交替光照，給予充足的水源和飼料。適應環境7 d后進行實驗，所有實驗均在白天進行，大鼠的使用和喂養嚴格遵照河北醫科大學倫理委員會和動物保護協會所規定的有關條款執行。

1.2 主要儀器和試劑 儀器:RTY-1型熱痛刺激儀(第四軍醫大學生理教研室研制);BME-403型Von frey機械刺激儀(中國醫學科學院生物工程研究所提供);BB16uv型CO2恒溫培養箱(德國Heraeus公司生產);恒溫搖床(重慶醫用器材廠生產);Gel Doc 2000凝膠成像分析系統(美國Bio-Rad公司生產)。試劑:兔抗大鼠CD55多克隆抗體，批號:CD55(H-319):sc-9156，美國Santa Cruz公司生產;辣根酶標記的山羊抗兔IgG(H+L)親和純化二抗，購自北京中山生物技術有限公司。

1.3 模型的制作 制作大鼠CCI和SNI模型:①CCI模型:大鼠俯臥位捆綁，從后肢上部切開皮膚，分離肌肉，暴露坐骨神經主干，使用羊腸線環繞坐骨神經主干并單結固定，羊腸線應能夠在坐骨神經主干上滑動。②SNI模型:于大鼠后肢上緣切開皮膚，分離肌肉，暴露坐骨神經主干及其下的分支——脛神經、腓總神經和腓腸神經，結扎并剪斷脛神經和腓總神經，保留細小的腓腸神經，并避免損傷［4］。假手術組:大鼠只暴露坐骨神經，不予結扎，然后逐層縫合。

1.4 行為學測定 分別在術前、術后1 d、3 d和7 d進行痛閾值測定。

1.4.1 熱痛閾測定:用RYT-1型熱痛刺激儀測大鼠熱縮足潛伏期(paw withdrawal thermal latency，PWTL)。參照文獻［5］方法進行，于上午8:00～12:00測定，先將大鼠放在熱刺激儀的玻璃操作臺上適應5 min，調節光強度，單次照射時間不超過30 s，以免造成熱輻射損傷，每肢照射3次，取其平均值。為避免或減少一次刺激對隨后刺激效應造成的影響，同一部位刺激的間隔時間為5 min。

1.4.2 機械痛閾測定:參照文獻［6］的方法測定機械縮足閾值(PWMT)，將大鼠置于升高的金屬網上，并蓋以透明的有機玻璃罩，適應20 min，用不同壓力的纖維絲(從小到大)垂直刺激其足底2、3跖趾間皮膚敏感處，逐漸加壓使之成為S形并持續6～8 s，觀察是否出現縮足反應，大鼠在刺激時間內或在移開Von frey纖維時立即出現快速的縮足反應，記為陽性反應，而身體活動所引起的縮足反應不記作陽性反應。每次間隔5 s，連續10次，誘發4～6次縮足反應作為50%反應率，其壓力值即為閾值。

1.5 免疫組化染色 采用SP法對大鼠脊髓標本進行免疫組化染色。腹腔注射1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后，經左心室灌注200 ml生理鹽水和300 ml 4%多聚甲醛溶液，充分固定后，縱向剖開椎管，取腰4～6脊髓組織，固定 24 h，經脫水、透明，石蠟包埋切片，切片厚度為4 μm。石蠟切片經二甲苯透明，常規梯度乙醇脫蠟，浸入0.01 mol/L、pH值為6.0的枸櫞酸鹽溶液中，加熱至98℃進行抗原修復30 min，3%H2O2去離子水室溫孵育20 min，正常兔血清封閉液室溫孵育20 min。滴加兔抗大鼠CD55多克隆抗體4℃孵育過夜，同時用PBS代替兔抗大鼠CD55多克隆抗體作為陰性對照。PBS液充分洗滌后，加入辣根酶標記兔抗山羊 IgG 37℃孵育30 min。DAB顯色，蘇木精復染，透明、封片。在OLYPUS顯微鏡下觀察，胞膜和胞質中有棕黃色顆粒者為陽性細胞，以CD55陽性細胞數(隨機取5個高倍視野，以其平均值作為一個標本的陽性細胞數)表示各切片CD55蛋白的相對表達水平。

1.6 Western blot檢測 采用Western blot法測定大鼠脊髓背角CD55蛋白的表達。于術后第7天處死大鼠取腰4～6段脊髓背角，將少量組織置于1.5 ml EP管中，加入裂解液，超聲勻漿，4℃下14000 r/min離心15 min，取上清，采用BCA法測定蛋白濃度。取40 μg蛋白上樣品，8%(w/v)SDS-PAGE 電泳，半干轉法轉膜。印跡膜片用5%脫脂奶粉封閉1 h，大膜片加入抗大鼠CD55單克隆抗體，小膜片加入羊抗actin抗體，4℃過夜。用 Tris/0.05%吐溫 －20(TBST)洗膜(5 min×3)，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗(山羊抗鼠 IgG)，37℃孵育1 h，TBST充分洗膜(5 min×3)，TBS洗膜10 min。最后印跡膜片與強化學發光試劑ECL溫浴l min，X光膠片曝光30～60 s，經顯影和定影顯示特異的蛋白信號。大膜片經膜再生液再生(37℃孵育30 min)后孵育鼠抗NR2B抗體，程序同前。信號條帶掃描后，用Quantity one 4.5.0圖像分析軟件進行定量分析，以與β-actin條帶的光密度比值反映CD55蛋白表達的相對水平。

1.7 統計學分析 采用SPSS 13.0統計學軟件進行分析，計量資料采用均數±標準差(±s)表示，組內采用t檢驗、組間采用重復測量數據方差分析，α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 痛閾值情況 與術前相比，術后1 d 3組大鼠PWTL和PWMT都降低，差異有統計學意義(P＜0.05)。術后第3、7天CCI組、SNI組與術前及假手術組同時點比較PWTL和PWMT持續降低，差異有統計學意義(P＜0.05)。而假手術組大鼠痛閾值逐漸恢復到術前水平，見表1。

2.2 脊髓背角免疫組化染色結果 假手術組脊髓背角陽性細胞數(16±4)個，CCI組(6±2)個，SNI組(10±3)個。假手術組明顯多于 CCI組和SNI組，差異有統計學意義(P＜0.05)。SNI組與CCI組相比差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖1、2。

2.3 Western-blot實驗結果 β-actin條帶的光密度積分(IOD)一致，即總蛋白上樣量一致。假手術組大鼠脊髓背角 CD55表達量為1.15±0.26，CCI組為0.37 ±0.19，SNI組為 0.51 ±0.22。與假手術組相比，CCI組、SNI組大鼠脊髓背角CD55表達量顯著降低，差異有統計學意義(P＜0.05)。見圖3。

表1 3組大鼠痛閾值比較(±s)

表1 3組大鼠痛閾值比較(±s)

注:與本組術前相比，aP＜0.05;與假手術組同時點相比，cP＜0.05

組別 鼠數 熱縮足潛伏期(s)機械縮足閾值(g)假手術組20術前 17.3 ±2.5 14.2 ±1.9術后1 d 13.7 ±1.7a 9.5 ±3.1a術后3 d 16.6 ±2.3 13.8 ±2.8術后7 d 16.8 ±2.2 13.7 ±2.5慢性坐骨神經縮窄損傷模型組 20術前 17.5 ±1.9 14.8 ±3.2術后1 d 12.8 ±3.2a 7.6 ±1.9a術后3 d 11.6 ±2.1ac 8.8 ±2.5ac術后7 d 11.9 ±3.0ac 8.2 ±1.4ac保留性脊神經損傷模型組 20術前 17.7 ±2.9 13.9 ±2.0術后1 d 14.0 ±2.2a 7.8 ±1.5a術后3 d 12.8 ±1.8ac 7.4 ±2.2ac術后7 d 13.4 ±3.5ac 7.8 ±1.7ac

圖1 3組大鼠脊髓背角CD55陽性細胞表達情況(SP×400)

圖2 3組大鼠脊髓背角CD55陽性細胞數柱狀圖

圖3 3組大鼠脊髓背角CD55蛋白的表達情況

3 討論

正常情況下，體內產生相當數量的補體調節蛋白，以特定的方式與補體相互作用，使補體的激活和抑制處于平衡狀態。補體調節蛋白包括可溶性蛋白和膜結合型蛋白兩類?？扇苄缘鞍装–1抑制物、C4結合蛋白、H因子、I因子、S蛋白等，主要在血清中發揮調節作用;膜結合型補體調節蛋白包括膜輔助蛋白(CD46)、CD55、調節素(CD59)及補體受體1等，前三者主要表達在細胞膜上，防止自身組織遭受補體攻擊［7-8］。

CD55蛋白表達于所有外周血細胞、內皮細胞和黏膜上皮細胞表面，可同C2競爭與C4b的結合，從而抑制C4b2b形成并促進其分解，也可促進Bb從已形成的C3bBb中解離［9-10］。CD55蛋白作為補體調節蛋白在補體級聯反應的開始就發揮調節作用，其在補體調節蛋白家族中地位顯著，意義重大。

關于補體調節蛋白在中樞神經系統疾病中的研究已有大量報道。Bonifati［11］報道 CD55表達下調是帕金森患者腦內補體異?；罨闹匾蛩亍mmerling［12］指出補體調節蛋白的表達異常是海默森患者發病的元兇。但補體調節蛋白在NPP中的研究尚屬首次。前期研究表明，在NPP形成過程中脊髓背角發生異常的補體活化，許多補體蛋白表達增高。為了增加本項研究的可靠性和重復性，本研究建立了兩種外周損傷型NPP模型，采用目前測定大鼠痛閾值的可靠技術熱痛刺激方法和機械痛刺激方法評估動物模型的穩定性，于建模后第7天斷頭處死大鼠，采用免疫組化技術和免疫印跡技術對模型大鼠脊髓中的CD55蛋白進行測定。結果顯示，兩種NPP模型脊髓中CD55蛋白水平在建模后表達發生了不同程度的降低，與假手術組相比有顯著差異。本研究結果與前期我們發現NPP時脊髓背角發生級聯反應是一致的。當外周神經發生損傷時，痛覺信號傳入中樞，脊髓背角膠質細胞活化，表達大量補體蛋白，進而觸發級聯反應［13-15］。正常情況下，由于細胞膜上表達的CD55蛋白可干擾C3轉化酶和C5轉化酶，阻斷補體級聯反應，保護自身細胞免受傷害。當CD55缺乏或表達下調時，補體級聯反應加劇，大量膜攻擊復合物形成，攻擊鄰近的神經元，使其內部構象改變，從而將傷害性信號上傳，經過大腦的信息整合，形成痛覺過敏。因此可以推測，NPP模型大鼠脊髓中CD55的表達下降可能是此處發生補體異?；罨脑?，至少是觸發因素之一。而有關NPP時脊髓中補體調節蛋白CD55表達下調的機制需要做進一步研究。

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