不同儲存年份的艾條燃燒生成自由基的ESR波譜研究

竇傳字 吳煥淦 洪宗國 崔云華 周次利 馬曉芃 劉慧榮 呂 豐 郭金云

(1上海中醫藥大學上海市針灸經絡研究所，上海，200030;2中南民族大學藥學院，武漢，430074)

灸法是中醫的基本療法，目前艾灸作用機制與安全性是灸法研究中亟待解決的兩大問題［1］。艾灸燃燒生成物的研究已成為艾灸安全性研究的重要組成部分，現有研究主要集中在艾葉燃燒產生的穩定化學成分［2－5］，卻忽略了艾灸過程中產生的自由基。自由基是含有單電子的化學基團，反應活性高，能與人體內不同分子發生反應。自由基影響酶的活化、參與白細胞免疫反應和人的衰老過程，還能導致基因突變與細胞凋亡［6－7］。本工作擬采用電子自旋共振儀(ESR)，配合相應的自由基捕捉劑和吸收液，對1年、3年、5年不同儲存年份艾條燃燒產生的自由基進行研究，從自由基角度探討新陳艾的安全性，為新陳艾安全性評價提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 湖北李時珍蘄艾制品廠產1年、3年、5年艾條。艾絨等級3∶1，直徑18 mm，長度200 mm，重量22 g，含水量≤13%。

1.2 實驗試劑與儀器 苯(A.R.，北京益利精細化學有限公司)，FeSO4·7H2O(A.R.，北京化學試劑三廠)，乙酸乙酯(A.R.，北京化工廠)，鄰苯二酚、對苯二酚、連苯三酚、氫氧化鈉(A.R.，國藥集團化學試劑有限公司)，PBN(phenyl－tert－ butynitrone，美國 SIGMA公司)，DETC(diethyldithiocarbamte，美國 SIGMA 公司)，劍橋濾紙(Cambridge filter)，電子自旋共振儀(ESP300，德國BRUKER公司)，珠江9型自動定時曝光器(廣州自動化儀表廠)，ACO系列電磁式空氣泵(浙江森森實業有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備 1)實驗準備:實驗前將艾條放入硅膠干燥劑中平衡24 h。在通風櫥內搭建如圖1所示實驗裝置，燃燒塔上方為倒置玻璃漏斗，玻璃管道中間以橡皮管相連，②為煙焦油捕集器，可更換濾紙，以捕集焦油自由基，③試管內加有相應自由基捕集劑，以捕集氣相自由基。

圖1 實驗裝置

2)溶液配置:分別配制10 mmol/L的PBN苯溶液、含6 mmol/L DETC和3 mmol/L FeSO4的水溶液作為自由基捕集液，現配現用。配制0.1 mol/L鄰苯二酚、對苯二酚、連苯三酚和氫氧化鈉溶液，備用。

3)自由基捕集:使用時每次吸取1 mL捕集液加入③試管中，更換②中濾紙。點燃艾條置于①燃燒塔內，待燃燒產生穩定煙氣后即打開空氣泵，使煙氣通過倒扣的漏斗進入玻璃管道，經②煙焦油捕集器捕捉焦油自由基，經③試管中PBN捕集液或(DETC)2－Fe2+復合物捕捉氣相自由基。每個樣本抽取1 min，重復5次。實驗過程中保持實驗室溫度為(22±2)℃，相對濕度為(55±10)%。

捕捉自由基完成后，將PBN捕集液移入1.5 mL EP管內，編號，放入冰盒，即刻進行ESR檢測。(DETC)2－Fe2+捕集液中加入0.3 mL乙酸乙酯，劇烈震蕩3 min，5000 g離心6 min，分離上清后低溫避光保存，用于ESR測定。將捕集焦油自由基后的濾紙編號，放入通風柜內攤開經24 h晾干，用于ESR檢測。

1.3.2 ESR波譜儀檢測條件 ESR波譜儀檢測前預熱1 h，室內溫度控制為21℃。ESR波譜儀檢測條件如下表1所示，ESR檢測波段為X波段，焦油自由基檢測功率為1.02 mW，氣相自由基檢測功率為12.8 mW，微波頻率為9.75 Hz，調頻100 kHz，調幅2.88e+00G，時間常數為327.68 ms。

表1 波譜儀檢測條件

1.3.3 檢測方法 檢測時抽取捕集自由基后的PBN捕集液400 μL加入直徑為4 mm的玻璃檢測管內，放入ESR檢測腔檢測。取收集到的乙酸乙酯溶液150 μL加入直徑2 mm的玻璃管內，放入ESR檢測腔內檢測。取晾干后的焦油自由基捕集濾紙，小心卷成條狀放入直徑為3 mm的透明塑料管內，放入ESR檢測腔檢測。

檢測前將0.1 mol/L的鄰苯二酚、對苯二酚和連苯三酚分別與氫氧化鈉溶液按1∶1體積混合，即刻用于ESR檢測，檢測條件與焦油自由基相同。

2 結果

2.1 艾條燃燒產生自由基的ESR圖譜

2.1.1 不同儲存期艾條燃燒產生焦油自由基圖譜焦油中自由基用濾紙捕集后可直接用ESR檢測得到如圖所示譜線，結合已有文獻報道［8］，煙焦油中主要含有醌/半醌自由基和多環芳烴自由基，可由電子自旋共振條件公式hν=gβH計算分析，醌/半醌自由基飽和功率在2 mW，而多環芳烴自由基飽和功率在100 mW，我們在1.02 mW功率下檢測到的ESR波譜中多環芳烴只占不到1%，主要為半醌類自由基(QH·)［9－10］。

2.1.2 不同儲存期艾條產生煙氣自由基經PBN捕集后獲得的圖譜 根據ESR波譜和超精細分裂常數，結合已有文獻報道，經PBN捕集的煙氣自由基主要包括:烷氧自由基(RO·)和烷類自由基(R·)［10］。

2.1.3 經(DETC)2－Fe2+復合物捕集到的煙氣自由基圖譜 DETC首先與亞鐵離子結合生成(DETC)2－Fe2+復合物，然后與 NO反應形成捕集復合物(DETC)2－Fe2+－NO，電子順磁共振檢測有三重峰特征譜線［11］。

圖2 不同儲存期艾條產生焦油自由基比較

圖3 PBN捕集到的煙氣自由基圖譜比較

圖4 (DETC)2－Fe2+復合物捕集到的煙氣自由基圖譜比較

2.1.4 半醌自由基再現反應生成自由基信號 鄰苯二酚、對苯二酚和連苯三酚分別與氫氧化鈉溶液反應，在1.02 mW功率下都可檢測到相同的自由基信號，以對苯二酚為例，文獻報道［10］，對苯二酚可在堿性條件下發生自氧化生成半醌自由基，這與我們得到的結果一致。

圖5 對苯二酚在堿性條件下產生的自由基ESR波譜

2.2 艾條燃燒產生自由基的相對含量 測量自由基ESR波譜各峰值信號強度的平均值，用以表示自由基的相對含量，不同儲存期艾條燃燒產生的焦油自由基及經捕集得到的氣相自由基信號強度見表2。

結果測得儲存期為3年、5年的艾條燃燒產生醌/半醌自由基、烷類和烷氧自由基以及NO自由基的信號強度都低于1年艾條(P＜0.05，P＜0.01)，而3年和5年艾條燃燒產生的醌/半醌自由基、烷類和烷氧自由基信號無統計學意義(P＞0.05)，5年艾條燃燒產生的NO自由基信號強度低于3年艾條(P＜0.01)。

表2 不同儲存期艾條產生自由基信號強度(s)

表2 不同儲存期艾條產生自由基信號強度(s)

注:與1年艾條比較，*P＜0.05;與1年艾條比較，＊＊P＜0.01;與3年艾條比較，△△P＜0.01。

儲存年份樣本量 焦油自由基 PBN捕集自由基 NO 自由基1年 5 9422.20±1114.22 9861.80±932.42 6205.60±4＊＊△△86.18 3年 5 7730.60±1207.52*8444.66±648.28* 4673.07±634.48＊＊5年 5 7500.80±1233.58* 8468.33±1004.02* 3474.40±336.08

3 討論

艾灸是中醫臨床常用的治療方法。古代醫家認為艾灸臨床療效以陳艾為佳。《孟子·離婁上》云:“猶七年之病，求三年之艾”?！侗静菥V目》載:“凡用艾葉，需用陳久者，治令細軟，謂之熟艾，若生艾灸火，則易傷人肌脈?！爆F代研究認為:伴隨艾存儲時間的延長，艾葉揮發油總量減少，揮發油中多數烯類、部分醇類與醛類化合物的含量也逐漸降低，而各化合物相應的醇、酮、酸等氧化產物的含量則逐漸增多［12］。陳艾揮發油減少使其燃燒更加緩慢柔和，并推測陳艾經過幾年的存放，有害物質揮發殆盡而安全性提高［13］。本研究中，儲存時間較長的艾條(3年艾條、5年艾條)燃燒產生的焦油自由基和煙氣自由基比儲存時間較短的艾條(1年艾條)燃燒產生的自由基少。

自由基是具有未配對電子的原子、原子團、分子或離子，可由共價鍵的熱分解、輻射分解和氧化還原反應產生。自然界中廣泛存在各類自由基，自由基既可以繼續生成新自由基，又可以與其他自由基反應變成惰性分子，實現自由基的湮滅。生物體內的自由基一方面能產生脂質過氧化損傷、影響酶活性而對人體產生損害，另一方面也可以被人體利用從而參與ATP供能、殺傷病原微生物等一系列生理過程［14－15］。

煙焦油中含有醌/半醌自由基和多環芳烴自由基，我們采集后并經過24 h晾干的艾煙焦油中仍可檢測到醌/半醌自由基信號，說明焦油自由基性質比較穩定。已有的研究表明，艾葉中主要含揮發油、黃酮、鞣酸、三萜類、烷烴類成分等［16］。而對黃酮抗氧化作用機制研究發現，黃酮可以通過酚羥基與氧自由基反應生成較穩定的半醌式自由基，從而中止鏈式反應［17］。半醌以穩定的自由基負離子中間體形式存在，可被氧化成苯醌，又可以還原得到對苯二酚，而對苯二酚具有活潑羥基，O－H鍵能夠均裂生成半醌自由基［18－19］。艾燃燒生成物中也檢測出含有鄰苯二酚、對苯二酚、連苯三酚等物質［3－4］。我們接下來運用ESR波譜儀對鄰苯二酚、對苯二酚、連苯三酚在堿性條件下產生的自由基圖譜進行了研究，當檢測條件與焦油自由基相同時，可以檢測到典型的半醌自由基圖譜，見圖5。這和日本研究者發現艾煙在堿性環境下生成半醌自由基的報道相一致［20］。由此我們推斷，艾葉中黃酮、鞣酸等物質在燃燒過程中裂解氧化，產生半醌自由基，并最終生成穩定的酚類物質。通過相應穩定物質如對苯二酚、鄰苯二酚、連苯三酚與堿作用可以再現得到半醌自由基，這一發現為我們進一步檢測這些半醌自由基的生物活性奠定基礎。

氣相自由基不能用ESR波譜儀直接觀察，需要采用自旋捕集技術將不穩定自由基捕捉后轉化成一種能用ESR波譜儀檢測的自旋加合物，這里用的自旋捕集劑PBN，對烷基自由基和烷氧自由基有特異捕捉能力，而(DETC)2－Fe2+復合物可以特異性的捕捉NO自由基。烷氧自由基的壽命極短(＜1 s)，可在煙氣流動過程中生成，產生毒理學作用［21］。艾葉中揮發油與長鏈烷烴成分在燃燒過程中可裂解生成烷基自由基，與氧氣發生過氧化生成烷氧自由基。NO是艾條燃燒過程中經氧化產生的中間產物，為自由基結構。通過NO產生烷基與烷氧基自由基，其反應過程為［10］:

艾葉燃煙具有室內空氣消毒的作用，古代用以防治瘟疫［22］，除了艾煙中的穩定化學成分如揮發油［23］、酚類具有滅菌作用，自由基與微生物之間更容易發生相互作用。同時，由于艾灸產生的焦油自由基半衰期長，結構相對穩定，有充分的時間進入人體呼吸道，可能會導致基因誘變與細胞凋亡，是艾灸安全性的重要隱患。因此有必要對艾煙中自由基的生物活性和安全性做更深入的研究。

艾條燃燒生成自由基，我們檢測到焦油自由基以醌/半醌自由基(Q·/QH·)為主，煙氣自由基包括烷氧自由基(RO·)、烷類自由基(R·)和NO自由基。儲存期3年和5年艾條燃燒生成的醌/半醌自由基、烷氧自由基(RO·)和烷類自由基(R·)要少于1年艾條，從自由基可能存在的安全隱患考慮，儲存期為3年和5年的艾條安全性要優于1年艾條。本研究成功由艾灸生成物中的酚類物質再現得到醌/半醌自由基，為進一步研究艾灸生成物中自由基的生物活性提供了基礎。

(感謝中國科學院生物物理研究所趙保路教授、張俊敬老師，中國科學院化學研究所田秋老師對本研究提供的幫助。)

［1］吳煥淦，嚴潔，余曙光，等.灸法研究的現狀與發展趨勢［J］.上海針灸雜志，2009，2(1):1 －6.

［2］李強，蔣伯誠，馬春華，等.關于艾灸煙霧化學成分的實驗分析［J］.黑龍江中醫藥，1993，16(4):44 －46.

［3］洪宗國，農熠瑛，江丹，等.艾葉燃燒產物化學成分的分析［J］.中國針灸，2009，29(增刊):60 －62.

［4］靳然，趙百孝，于密密，等.艾燃燒生成物組分固相微萃取煙氣色譜質譜法定性分析［J］.北京中醫藥大學學報，2011，34(9):632－636.

［5］Zhou CL，Feng XM，Wang JH，et al.Research advance on moxa smoke［J］.J Acupunct Tuina Sci，2011，9(2):67 －72.

［6］趙保路.自由基生物學與物理學［J］.物理，2007，36(8):579 －583.

［7］趙保路，張春愛，傅文慶，等.活性氧自由基和細胞凋亡［J］.自然雜志，1996，18(6):324 －327.

［8］李澤彬，殷春浩，呂海萍，等.電子順磁共振儀的參數最佳選擇［J］.徐州工程學院學報，2007，22(8):22 －25，85.

［9］Pryor WA，Hales BJ，Premovic PI，et al.The radicals in cigarette tar:their nature and suggested physiological implications［J］.Science，1983，220:425－427.

［10］趙保路.電子自旋共振技術在生物和醫學中的應用［M］.合肥:中國科學技術大學出版社，2009:370－371.

［11］Mordvintcev P，Mülsch A，Busse R，et al.On － line detection of nitric oxide formation in liquid aqueous phase by electron paramagnetic resonance spectroscopy.Anal Biochem，1991，199(1):142 －146.

［12］何正有，張艷紅，魏冬，等.湖北產鮮艾與陳艾揮發油的化學成分［J］.中成藥，2009，31(7):1079 －1082.

［13］靳然，孟笑男，趙百孝.灸用艾葉的道地藥材及加工標準的探討［J］.中國針灸，2010，30(1):40 －42.

［14］姜招峰.自由基醫學的基礎理論［J］.齊齊哈爾醫學院學報，1990，11(1):39 －42，48.

［15］王峰.關于自由基概念的“串講”［J］.高分子材料科學與工程，2012，28(1):184 －186.

［16］周次利，譚琳鎣，王曉梅，等.艾化學成分的生物學作用與影響因素探討［J］.上海針灸雜志，2010，29(2):74 －76.

［17］張紅雨.黃酮類抗氧化劑結構活性關系的理論解釋［J］.中國科學(B 輯)，1999，29(1):91 －96.

［18］Valgimigli L，Amorati R，Fumo MG，et al.The unusual reaction of semiquinone radicals with molecular oxygen［J］.J Org Chem，2008，73(5):1830－1841.

［19］馬瑞進，龍翔云，尹作棟.對苯二酚成鍵特性及半醌穩定性的量子化學研究［J］.化工技術與開發，2008，37(8):8 －9.

［20］Sakagami H，Matsumoto H，Satoh K，et al.Cytotoxicity and radical modulating activity of moxa smoke［J］.In Vivo，2005，19:391 －398.

［21］Church DF，Pryor WA.Free－ radical chemistry of cigarette smoke and its toxicological implications［J］.Environ Health Perspect，1985，64:111.

［22］林永清，趙百孝.艾灸防止疫病的歷史與現狀［J］.遼寧中醫雜志，2010，37:279 －280.

［23］洪宗國，周西友，伊定，等.蘄艾油抑菌作用研究［J］.中南民族學院學報:自然科學版，1995，14(1):57 －59.