風藥、補虛藥對腦缺血大鼠淀粉樣β蛋白及其蛋白前體表達的影響

王海征 張秋霞 趙 暉 張 弛 張 楠 王雅麗 楊亦龍

(1首都醫科大學中醫藥學院，北京，100069;2北京中醫藥大學期刊中心，北京，100029)

醫圣張仲景在《內經》的基礎上，提出了中風的病名，認為中風的病機是“內虛邪中”。侯氏黑散是張仲景針對中風“正虛邪中”病機關鍵而創立的治療中風“第一方”［1］。方中以風藥(菊花、防風、桂枝、川芎、細辛、桔梗)祛風、搜風、熄風，配伍補虛藥(白術、人參、茯苓、當歸)益氣健脾、補益肝血，充分體現了風藥佐助補虛藥治療腦中風的用藥特色。《經方發揮》認為“《金匱要略》之侯氏黑散……列為治中風之首方，絕非偶然，而是有其深刻意義?！鼻捌谘芯勘砻鳎?－6］，侯氏黑散可通過調節神經營養因子、控制星形膠質細胞的適度活化，減少炎性反應因子的釋放，對腦缺血大鼠神經血管單元有很好的保護作用。為進一步闡釋侯氏黑散組方之精妙，本文利用免疫組化方法觀察淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)、β－淀粉樣蛋白(β－amyloid protein，Aβ)在缺血大鼠腦組織的表達變化，探討侯氏黑散方中風藥、補虛藥及風藥補虛藥聯用對腦缺血大鼠軸突轉運及淀粉樣沉淀的影響。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 雄性Sprague－Dawley大鼠，清潔級，體重280～300 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供(許可證號為SCXK(京)2012－0001)。飼養于首都醫科大學實驗動物中心(許可證號為SYXK(JING)2010－0020)。將動物分為假手術組、模型組、風藥組、補虛藥組、風藥補虛藥聯用組(簡稱聯用藥組)。

1.2 受試藥物 侯氏黑散方中主要藥物分為風藥組、補虛藥組。風藥由菊花40 g、防風10 g、桂枝3 g、川芎3 g、細辛3 g、桔梗8 g組成;補虛藥由人參3 g、白術10 g、茯苓3 g、干姜3 g、當歸3 g組成。(藥物劑量依據《金匱要略》侯氏黑散原方的劑量比例確定)。風藥補虛藥聯用組由菊花40 g、防風10 g、桂枝3 g、川芎3 g、細辛3 g、桔梗8 g、生白術10 g、茯苓3 g、干姜3 g、當歸3 g、人參3 g組成。中藥購自北京同仁堂藥店。

1.3 試劑 APP:#1565－1，EPITOMICS;Aβ42:ab10148，Abcam;山羊抗兔IgG －HRP:ANR02－1，欣博盛生物;蘇木素:CW0127，北京康為世紀生物科技有限公司;DAB，ZLI－9018，中杉金橋;3%H2O2，中杉金橋;兔超敏二步法檢測試劑盒:PV－9001，中杉金橋。

1.4 主要儀器 DENVER INSTRUMENT電子天平:北京賽多利萁儀器系統有限公司;微波爐(PTOD20TL－D4):格蘭仕微波爐電器有限公司;電熱鼓風干燥箱:天津市泰斯特儀器有限公司;MENLAB－U/4C501H生物信號采集處理系統:南京美易科技有限公司;光學顯微鏡Nikon Eclipse 80i:日本;渦旋振蕩器(VG3S25):IKA公司;臺式離心機(94－108):Sigma公司;AR1140電子天平:美國Adrenturer公司;NIS－Elements Basic Research圖像采集分析系統，日本;centrifuge 5810R離心機:美國Eppendorf公司。

2 實驗方法

2.1 腦缺血大鼠模型制備 參照文獻［7］制備大腦中動脈永久性缺血模型。雄性Sprague－Dawley大鼠，麻醉后，仰臥固定，結扎頸總動脈近心端和頸外動脈。將預先處理成圓頭的尼龍線(直徑0.265 mm)置于頸內動脈18 mm，阻斷大腦中動脈的血液供應，扎緊動脈殘端，縫合皮膚。假手術組大鼠麻醉后，僅暴露頸內外動脈分支，不閉塞大腦中動脈。參考Zea Longa［8］法于缺血24 h、48 h進行神經功能缺損評分。通過神經功能評分判斷腦缺血模型的成功與否，2～3分為入選動物。

2.2 分組及給藥 60只SD雄性大鼠，用隨機數字表方法將實驗動物隨機分為5組，即假手術組、模型組、風藥組、補虛藥組，聯用藥組，每組12只動物。給藥劑量按體表面積折算，風藥組等效劑量為7.7 g/kg;補虛藥組等效劑量為2.59 g/kg;聯用藥組等效劑量為10.5 g/kg。各給藥組先灌胃給藥3 d，第4 d給藥后20 min施行手術，術后24 h及48 h各組每6 h給藥1次。模型組灌胃等容量生理鹽水。

2.3 取材及標本處理 大鼠造模后分別于缺血24 h、48 h取材。每組隨機取5只大鼠，麻醉后，生理鹽水快速灌流至清澈。繼以4%多聚甲醛0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH7.4)心內灌注固定，待充分固定后，開顱取腦。冠狀位取視交叉向尾端3～4 mm組織塊，投入相同固定液于4℃固定1周后，常規石蠟包埋，切片，進行免疫組化染色。

2.4 APP、Aβ42檢測 采用二步法免疫組織化學染色法進行染色。APP、Aβ42免疫組織化學染色暴露抗原方法:用0.01 mol/L的檸檬酸緩沖液進行微波修復，PBS沖洗。然后每片滴加一抗50 μL(APP抗體稀釋濃度1∶100;Aβ42抗體稀釋濃度1∶50)，4℃孵育40 h，37℃孵育1 h，PBS沖洗。接著每片滴加二抗Ⅰ50 μL，37℃孵育0.5 h，PBS沖洗，每片滴加二抗Ⅱ50 μL，37℃孵育1 h，PBS沖洗。最后DAB顯色25 min，蒸餾水洗滌終止，蘇木素染細胞核5 min，顯色后脫水、透明、封片。

表1 風藥、補虛藥對腦缺血大鼠皮層APP表達的影響(IOD:s，n=5)

表1 風藥、補虛藥對腦缺血大鼠皮層APP表達的影響(IOD:s，n=5)

注:與模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P＜0.01。

假手術組 7633.21±4908.46＊＊ 8962.43±6059.67＊＊模型組 16067.40±11588.74 25097.16±13264.01風藥組 12843.80±5874.36 16542.14±5403.21*補虛藥組 10634.40±3613.26* 20982.00±6772.84聯用藥組 6528.33±2705.76＊＊24905.17±15243.36

表2 風藥、補虛藥對腦缺血大鼠皮層Aβ42表達的影響(IOD:s，n=5)

表2 風藥、補虛藥對腦缺血大鼠皮層Aβ42表達的影響(IOD:s，n=5)

注:與模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P＜0.01。

24 h 48 h假手術組 855.00±761.71＊＊ 794.50±511.03組別＊＊模型組 13547.69±7183.60 17395.77±9104.63風藥組 12829.25±5865.49 12245.82±5873.84補虛藥組 11248.00±7170.08 17295.00±12773.28聯用藥組 12743.56±9080.78 9743.00±4618.24＊＊

2.5 圖像分析 在Olympus光學顯微鏡下觀察免疫組化染色切片，在各組動物右側(缺血側)顳葉皮層選取5個視野，LEICA數字顯微照相機采集圖像，利用NIS－Elements Basic Research圖像采集分析系統分析每個視野下APP及 Aβ42陽性表達的積分光密度(IOD，integrated optical density)以反映APP及Aβ42免疫染色強度。

3 結果

APP表達主要位于神經元核周體及周圍的軸突部位。缺血24 h后，缺血側腦組織APP免疫反應明顯增強，棕黃色顆粒增多，染色加深，免疫陽性細胞呈叢狀聚集。圖像分析結果顯示，缺血24 h、48 h大鼠顳葉皮層APP表達明顯高于假手術組(P＜0.01);與模型組相比，補虛藥、聯用藥可明顯下調缺血24 h大鼠顳葉皮層APP的表達(P＜0.01或P＜0.05);缺血48 h，風藥組大鼠顳葉皮層APP表達也明顯低于模型組(P＜0.05)。見表1，圖1。

Aβ42陽性表達物為棕褐色顆粒，分布于神經元細胞質中，并可見細胞核皺縮。隨著缺血時間延長，Aβ42陽性表達增強。圖像分析結果顯示，缺血24 h、48 h大鼠顳葉皮層Aβ42表達較假手術組增強(P＜0.01);風藥補虛藥聯用可明顯下調缺血48 h大鼠顳葉皮層Aβ42表達，差異較模型組顯著(P＜0.01)。見表 2，圖 2。

圖1 腦缺血后大鼠皮層APP表達的變化(bar=50 μm)

圖2 腦缺血后大鼠皮層Aβ42表達的變化(bar=50 μm)

4 討論

淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)為具有受體樣結構的跨膜糖蛋白［9］，通過軸漿快速順行運輸，具有維護突觸膜穩定，促進細胞黏附、增殖和分化，抑制絲氨酸蛋白酶活性等作用［10］。近期研究表明，淀粉樣前體蛋白也參與腦缺血損傷過程［11－13］，并且是腦缺血的敏感指標之一［14］。在本實驗中我們發現，局灶性腦缺血24 h后，缺血側腦組織APP生成增多，APP代謝產物Aβ42表達明顯增高，隨著缺血時間延長，APP、Aβ42表達均成上升趨勢。軸突纖維易受到缺氧或缺血性損傷［15］，相關研究表明，局灶性腦缺血2 h后，就可見細胞骨架破壞，有髓纖維快速軸突運輸發生障礙［16］。APP作為軸突損傷后的一種快速反應性蛋白在軸突微管結構破壞，細胞骨架崩潰后，出現異常聚集［17］，APP的代謝方式有淀粉樣降解途徑(amyloidogenic pathway)和非淀粉樣降解途徑(nonamyloidogenic pathway)。生理狀態下，APP主要經非淀粉樣降解途徑代謝，而病理狀態下，APP則以淀粉樣降解途徑代謝，產生過量的Aβ42與Aβ40，造成Aβ的積聚［18］。目前研究表明APP的過度表達可直接引起神經損害，促神經細胞凋亡［19］。但APP的神經毒性主要是由APP異常裂解產生的Aβ所引起。Aβ42與Aβ40相比，延長的兩個氨基不僅增加了Aβ的疏水性，而且使其更容易聚集，具有較強的神經毒性［20］，可觸及多種毒性機制:如通過突觸體脂質過氧化物作用，引起自由基生成和氧化應激，損傷神經元;并通過擾亂細胞內環境的穩定，誘導細胞凋亡［21－22］;還可直接激活補體系統，通過補體經典途徑和膜攻擊復合物介導產生神經毒性［23－24］。因而調節 APP表達，抑制 Aβ42異常聚集，可減輕神經元損傷并減緩神經元退行性變進程。

現代《中藥學》以功效分類，將大部分風藥歸入解表藥中，突出了它們發散表邪、解除表證的作用，卻淡化了其他一些重要功能，在一定程度上束縛了風藥的應用范圍。侯氏黑散是仲景治療缺血性腦中風的主方，方中集合諸藥祛風、搜風、熄風:菊花用至四十分，祛風平肝;防風用至十分，助菊花祛風;川芎亦治風，本經謂治“中風入腦頭痛”;細辛善治暗風卒倒(《世醫得效方》);桂枝祛風更為仲景所推崇。配以白術、人參、茯苓益氣健脾，當歸補肝血、潤肝燥。全方體現了風藥佐助補虛藥“補不足，損有余”的立法思想。本研究利用經典的腦缺血大鼠模型，探討侯氏黑散方中風藥、補虛藥對淀粉樣β蛋白及其蛋白前體表達的單獨效應及聯合作用。結果表明，風藥、補虛藥單獨應用雖可不同程度降低APP表達，但對Aβ42的異常積聚沒有明顯的阻抑作用，補虛藥與風藥聯用可明顯下調APP表達，抑制Aβ4的異常積聚，降低Aβ42的毒性，從而發揮神經元的保護作用。仲景作為中醫學理、法、方、藥的奠基人，治療腦中風善用“風藥”，所立經方中“風藥”妙用者舉不勝舉。長期的醫療實踐證明，風藥非獨祛風，在調節人體臟腑經絡、暢達氣血津液等方面有著重要的意義，應用范圍相當廣泛，尤其在多種配伍中具有獨特增效作用［25－26］。因此深入探討風藥佐助補虛藥抗腦血損傷的作用機制，不僅有助于闡釋仲景“內虛邪中”腦中風病機理論，還可指導風藥在腦卒中臨床治療的合理配伍應用，拓寬中醫治療腦中風的思路。

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