聚乙烯醇二次交聯固定錳氧化細菌的試驗

王景晶，張長利，楊 宏

（北京工業大學建筑工程學院，北京 100124）

錳是人體必需的微量元素之一[1,2]，但是過量錳的攝入會引起人體神經系統的病變。我國《生活飲用水衛生標準》（GB 5749—2006）規定錳的含量最高為0.1 mg／L。世界衛生組織和歐盟對生活飲用水中錳含量的理想標準值規定為0.05 mg／L，目前世界多國都面臨地下水的錳超標問題[3-5]。生物除錳技術無需投加化學藥劑，有較高的除錳效率而且運行管理費用較低，逐漸取代物理和化學除錳法應用于實際工程。但是，由于具有錳氧化能力的細菌在開放的環境中很難建立起種群優勢，作為生物除錳技術核心的生物濾池在啟動階段較長、抗沖擊負荷能力較弱。根據文獻報道，濾池的成熟過程往往需要4～6周[6,7]。細胞固定化技術可以將大量細菌固定在載體材料中，然后投入濾池中，從而實現在生物濾池中啟動初期就有大量的錳氧化細菌，大大縮短除錳生物濾池的啟動期并提高生物濾池的運行穩定性。

PVA是目前研究較多細胞固定的載體,它具有強度高、化學穩定性好、價格低廉等優點。PVA的缺點在于分子結構中親水性羥基很多，羥基與水分子結合造成聚乙烯醇交聯后顆粒體積膨脹并發生粘連現象，而且交聯劑硼酸對細菌具有毒性[8-10]。李花子等[8]認為PVA的粘連膨脹是由于硼酸上的3個羥基部分發生反應,交聯后的高聚物凝膠上殘留有親水性的羥基，采用延時包埋法和加入化學藥劑法,可改善PVA顆粒的水溶膨脹性。有些學者通過向PVA中添加海藻酸鈉、活性炭、沸石等物質，研究改善PVA顆粒的粘連現象[10-13]。

本文通過分布交聯調pH法固定錳氧化細菌，該方法實施簡單，既充分利用了PVA和飽和硼酸易成型的優點，又通過調節pH到弱堿性環境，使得硼酸以硼酸鹽的形式存在，降低了對細菌的傷害。經硼酸鹽強化后的PVA在使用過程中的粘連、水溶膨脹性大大降低。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌源采集

菌源采集自北京工業大學北京市水質科學與水環境恢復工程重點實驗室除錳濾池。

1.1.2 培養基

PYCM 培養基[14]：蛋白胨為 0.8 g、酵母浸膏為0.2 g、MnSO4·H2O 為 0.45 g、K2HPO4為 0.1 g、檸檬酸 鐵 銨 為 2.0 g、NaNO3為 0.2 g、CaCl2為 0.1 g、（NH4）2CO3為 0.1 g，加去離子水 1 000 mL，加入 1.5%的瓊脂，在121℃下高壓滅菌20 min。

PYCM培養基稀釋液：將PYCM培養基加純水稀釋6倍，其中Mn2+濃度為25 mg／L。

1.1.3 試驗試劑

PVA（工業純，北京化工廠）；硼酸（分析純，天津市福晨化學試劑廠）；海藻酸鈉（化學純，天津市光復精細化工研究所）；碳酸鈣（分析純，天津市福晨化學試劑廠）；瓊脂粉（北京奧博星生物技術責任有限公司）；活性碳（天津市塘沽天達凈化材料精細化工廠）。

1.1.4 主要儀器

Sanyo高壓滅菌鍋、OLYMPUS BX41顯微鏡、AAS vario6型原子吸收分光光度計、恒溫振蕩培養箱、冰箱、水浴鍋、玻璃儀器等。

1.2 試驗方法

1.2.1 PVA固定化錳氧化細菌的制備

按照一定質量分數將PVA加到去離子水中，在85～95℃水浴條件下邊攪拌邊溶解，在水浴鍋中邊加熱邊攪拌至溶解均勻的凝膠狀，冷卻至30～40℃，按照試驗需要將一定量的添加劑（w%）與錳氧化細菌（v%）加到PVA溶液中，攪拌均勻，然后把PVA凝膠液裝入注射器中滴定到飽和硼酸溶液（若海藻酸鈉作添加劑，飽和硼酸中需加入2%CaCl2作為交聯劑）中，固定1 h，然后根據試驗需要調節到一定pH，再次交聯一定時間，用孔徑為2 mm的篩網濾出小球，用生理鹽水洗凈，備用。

1.2.2 固定顆粒膨脹性的測定方法

體積膨脹率：體積膨脹率從一定程度上反映了固定化細胞的穩定性及耐用性，筆者經過試驗證實PVA固定顆粒在水中浸泡5 d后體積不再膨脹。取10 mL PVA小球放入裝有200 mL自來水的錐形瓶中浸泡5 d，每天定時測量其小球體積的變化。膨脹率=(浸泡后體積-初始體積)/初始體積。

1.2.3 固定顆粒機械強度的測定方法

機械強度的測定：首先在各組固定化小球中選取大小一致的小球各20顆，放入蒸餾水及玻璃球，在恒溫振蕩器中以200 r／min振蕩5 d，定時觀察小球的破損情況。記錄小球的破損個數，小球完好率=（總個數-破損個數）／總個數[15]。

1.2.4 固定錳氧化細菌活性的測定方法

將制備好的固定錳氧化細菌加入到30 mL PYCM培養基稀釋液中,120 r／min振蕩培養5 d，取2 mL水樣經0.25 μm濾膜過濾，用原子吸收分光光度法測定剩余錳濃度。為排除培養基和載體的影響，分別用去離子水配制相同濃度的錳溶液和無細菌的載體顆粒做空白對照試驗。錳細菌活性（相對活性）=（PYCM培養基稀釋液中Mn2+離子初始濃度-剩余Mn2+離子濃度）／PYCM培養基稀釋液中Mn2+離子初始濃度×100%。

2 試驗結果與討論

2.1 PVA濃度對固定細菌的影響

在二次交聯pH為9、二次交聯時間為12 h、包菌量為4%、加入4%碳酸鈣的條件下，改變PVA濃度制備固定錳氧化細菌，以考察PVA濃度對固定化細菌影響，如圖1所示。

通過5 d的膨脹率測定可知顆粒的膨脹程度隨PVA濃度的增加而增加，濃度為7%時膨脹率最低（55%）；濃度為12%時膨脹率最高（95%）；濃度為8%～10%時膨脹率變化較小。PVA顆粒交聯后化學結構中殘留有親水性羥基，羥基與水分子結合造成PVA高分子相互交錯結構的解體，大量水分子滲透到PVA小球結構內部，并促使PVA小球結構體膨脹。因此，PVA濃度越大吸收水分越多，解體后體積越大，膨脹率越大。經5 d浸泡后PVA濃度越低的顆粒的機械強度越差，7%PVA顆粒的完好率為40%，而濃度12%顆粒的完好率為95%。PVA顆粒膨脹后PVA高分子間的距離加大，分子間的作用力減弱，造成機械強度的降低。PVA濃度越低，PVA高分子數量越少，膨脹后分子之間的相對距離越大，機械強度降低越快。固定細菌活性的大小往往與顆粒傳質性有關，濃度越低的顆粒，內部孔隙越大，傳質性越高，特別是膨脹之后內部含水率增加，傳質性也迅速增加。

圖1 PVA濃度對固定細菌的影響Fig.1 Effect of Different Concentration of PVA on Immobilized Bacteria

由圖1可知顆粒內部包埋細菌的活性隨著濃度的增加而降低，PVA濃度為7%、12%時，5 d除錳率分別為 88.12%、45.72%。PVA 濃度為 9%～11%時，細菌活性變化不大，穩定在55%左右。

2.2 二次交聯pH對固定細菌的影響

在PVA濃度為9%、二次交聯時間為12 h，包菌量為4%、添加4%碳酸鈣的條件下，改變二次交聯pH制備固定錳氧化細菌，以考察二次交聯固定pH對固定化細菌影響，如圖2所示。

圖2 二次交聯pH對固定細菌的影響Fig.2 Effect of different pH Value of Second Cross-Link Procedure on Immobilized Bacteria

pH對PVA顆粒的物理性狀及化學結構影響較大，安立超等[16]發現碳酸鈉溶液調節pH值制備PVA載體固定化微生物的方法可增強固定化微生物載體的耐曝氣強度和機械強度。傳統飽和硼酸法交聯固定是在pH=5的酸性條件下進行,對生物毒性大,細胞活性會受較大影響[17]。但相對于其他交聯劑，硼酸具有成型快的優點，因此本試驗采用二次交聯調pH法。首先在飽和硼酸中交聯1 h固定化細胞快速定型后，再將制備載體小球的交聯液pH值分別調為 5.00、6.00、7.00、8.00、9.00、10.00，二次交聯時間固定12 h。

由圖2可知二次交聯pH在5.00到7.00之間對膨脹率和機械強度沒有明顯作用，當二次交聯pH達到 8.00、9.00、10.00 時膨脹率減小，機械強度也增加。程傳煊等[18]采用紅外光譜分析等手段證實，堿性環境下PVA部分羥基能夠發生脫質子反應與水中金屬離子發生配位反應。由此可以判斷堿性環境有助于減少顆粒內部羥基數量，使PVA顆粒膨脹和機械強度得到改善。當pH為5.00～7.00時，固定細菌活性較低；當pH為8和9時，活性最高，錳去除率分別為80%和75%；當pH為10時，活性開始降低。分析原因：一方面是由于硼酸在酸性環境下的毒性較大；另一方面錳氧化細菌本身活性受pH影響較大。因此pH在7～9范圍內有利于錳氧化細菌的活性保持[7]。

2.3 二次交聯時間對固定細菌的影響

在PVA濃度為9%、二次交聯pH為9.0、包菌量為4%、添加4%碳酸鈣的條件下，改變二次交聯時間制備固定錳氧化細菌，以考察二次交聯固定時間對固定化細菌影響，如圖3所示。

由于顆粒傳質性的限制，堿性液體進入顆粒內部需要一定的時間，而且交聯反應也需要足夠的時間。當二次交聯時間為4～6 h時，反應時間不足，顆粒膨脹性和機械強度未得到明顯改善；當二次交聯時間為8～48 h時，二次交聯時交聯較好，膨脹率和機械強度分別穩定在70%和85%左右。當二次交聯時間在4～48 h變化時，固定細菌活性和交聯時間相關性不大，除錳率在45%左右，但是由于營養物質限制，二次交聯時間不宜超過48 h。

2.4 添加劑對固定細菌的影響

在PVA濃度為9%、二次交聯pH為9.0、二次交聯時間為12 h、包菌量為4%的條件下，分別加入不同添加劑制備固定錳氧化細菌，如圖4所示。

圖3 二次交聯時間對固定細菌的影響Fig.3 Effect of Different Time of Second Cross-Link Procedure on Immobilized Bacteria

圖4 添加劑對固定細菌的影響Fig.4 Effect of Different Co-Composite Matters on Immobilized Bacteria

四種添加劑中碳酸鈣、活性炭對膨脹性的改善效果最好，膨脹率分別為61%和95%。這是因為一方面不溶性的碳酸鈣和活性炭具有“位阻”作用，能夠阻止水中的氫離子（H+）與PVA分子上的羥基（-OH）結合[19]；另一方面碳酸鈣作為一種弱酸鹽，在水溶液中pH為9.5～10.2，能夠為PVA分子創造微堿性環境，堿性環境下水中氫離子數量減少，可有效改善PVA的水溶膨脹。海藻酸鈉和瓊脂加速了PVA的水溶膨脹。海藻酸鈉交聯后形成的海藻酸鈣會與水中的K+、Na+、Mg2+等陽離子發生置換反應而溶解[20]。瓊脂長期浸泡過程中添加劑自身會吸收大量水分，而且瓊脂會慢慢脫離載體而溶解到水中。

碳酸鈣、海藻酸鈉、瓊脂對PVA機械強度的改善較好，5 d小球完好率都在70%以上。加入活性炭的PVA凝膠的機械強度較差，小球5 d完好率僅為45%，可能是由于活性炭的加入破壞了PVA交聯后所形成的空間網狀結構。

碳酸鈣的加入影響到固定化錳氧化細菌微環境的pH，錳細菌氧化錳離子需要pH在7～9范圍內，碳酸鈣5 d除錳率只有64%。海藻酸鈉、瓊脂、活性炭的化學性質穩定，對錳氧化細菌微環境的pH和orp影響微小，這三種添加劑可以增大PVA小球的孔隙度和傳質性，有助于提高固定錳氧化細菌活性，5 d除錳率保持在75%左右。同時，活性炭具有微生物沒有的能力，能將底物吸附到內部微孔內，并逐漸釋放，吸附的物質90%被降解[21]。

2.5 包菌量對固定細菌的影響

在PVA濃度為9%、二次交聯pH為9.0，二次交聯時間為12 h、加入4%碳酸鈣的條件下，分別加入不同體積的菌液制備固定錳氧化細菌，如圖5所示。

圖5 包菌量對固定細菌的影響Fig.5 Effect of Amount of Embedded Bacteria on Immobilized Bacteria

當包菌量在1%～8%變化時，對膨脹性影響不大，膨脹率穩定在66%～73%。機械強度在包菌量小于4%時變化較小。但是當包菌量大于4%時機械強度有明顯的下降趨勢，說明加入菌液體積比超過4%，會對PVA交聯后的化學結構穩定性產生不利影響。

固定細菌的除錳能力與包菌量具有明顯的相關性，錳去除率隨著包菌量的增加而增加。這是因為包埋的細菌越多，固定后活細菌數量越多。此外，錳氧化細菌體液內含大量具有催化活性的酶，細菌死亡解體后將酶釋放到周圍環境中，細菌數量越多，環境中的錳氧化酶越多，除錳能力也越高。

3 結論

（1）顆粒的膨脹度及機械強度隨PVA濃度的增加而增加，由于傳質性的影響顆粒內部包埋細菌的活性隨著濃度的增加而降低。

（2）堿性環境有助于減少顆粒內部羥基數量，使PVA顆粒膨脹和機械強度得到改善，二次交聯pH在5.00到7.00之間對膨脹率和機械強度沒有明顯作用，在二次交聯 pH 達到 8.00、9.00、10.00 時膨脹率減小，機械強度也增加。pH 在 5.00～7.00時固定細菌活性較低，pH為8和9時活性最高，pH為10時的活性開始降低。

（3）二次交聯時間為4～6 h時，反應時間不足，顆粒膨脹性和機械強度未得到明顯改善。二次交聯時間為8～48 h時，膨脹率和機械強度分別穩定在70%和85%左右。二次交聯時間在4～48 h變化時，固定細菌活性和交聯時間相關性不大，但不宜超過48 h。

（4）四種添加劑中碳酸鈣、活性炭對膨脹性的改善效果最好，膨脹率分別為61%和95%。碳酸鈣、海藻酸鈉、瓊脂對PVA機械強度的改善較好。海藻酸鈉、瓊脂、活性炭有助于提高固定錳氧化細菌活性。碳酸鈣的加入影響到固定化錳氧化細菌微環境的pH，固定錳氧化細菌活性較低。

（5）包菌量在1%～8%變化時，對膨脹性影響不大，機械強度在包菌量小于4%時變化較小；當包菌量大于4%時機械強度有明顯的下降趨勢，錳去除率隨著包菌量的增加而增加。

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