糞腸球菌的二氧化氯消毒試驗

李榮光，何文杰，黃廷林，韓宏大，張甜甜，孟憲獻

腸球菌是存在于人類或動物胃腸道的正常菌群[1,2]。為革蘭氏陽性球菌，需氧或兼性厭氧，無鞭毛，無芽孢，少數菌株有莢膜，觸酶試驗陰性。自1984年以來，本菌屬已分離出至少19種基因型[3,4]，糞腸球菌（Enterococcus Faecalis）是其中的一種。腸道菌能通過飲用水傳播疾病，有效的消毒是保障飲用水安全的重要手段，通常以大腸桿菌為指示菌來評價消毒效果，但是只以一種細菌作為指示菌有很大的弊端，而目前腸球菌已被列入生活飲用水衛生標準附錄[5]，因此對腸球菌消毒效果的研究就顯得尤為重要。

通過實驗室配制的磷酸鹽緩沖液代替天然水進行試驗有利于避免混淆各水質因素對消毒效果的影響，可以非常方便地調整各水質因素（如pH、溫度）來研究它們對消毒效果的影響。大量的研究認為反應溫度和pH值對氯的消毒效果有重要影響[6-12]。pH值的變化會影響消毒劑水解的化學平衡，從而提高或降低消毒劑的活性；溫度的升高會增大消毒劑化學反應的速率；有機物的加入不但會消耗消毒劑，而且會起到穩定細菌的作用。

二氧化氯具有消毒能力強，持續時間長，消毒副產物少的優點也使其成為國際社會公認的氯系列消毒劑最理想的換代產品[13-15]。在美國有400多家水廠、歐洲有數千家水廠應用二氧化氯消毒[16]。在我國小規模的給水廠中亦有應用[17]，并且在農村也有應用[18]。

1 試驗材料和方法

1.1 消毒劑

二氧化氯試劑通過稀釋2%的穩定性二氧化氯獲得。消毒劑在每次使用前標定濃度。使用N－二乙基對苯二胺（DPD）法對消毒劑進行檢測，所用儀器為Pocket ColorimeterTMⅡ 二氧化氯檢測儀（美國HACH公司）。

1.2 磷酸鹽緩沖液（PBS）和菌懸液

磷酸鹽緩沖液用0.1 mol/L的磷酸氫二鈉和0.1 mol/L的無水磷酸二氫鈉制備，調節pH為6、7.5和9（除pH影響消毒效果的研究外，其余試驗均在pH=7.6±0.1的條件下進行）。

試驗所用菌種為美國典型菌種保藏中心提供的糞腸球菌（ATCC19433）。菌懸液的制?。河? mL的生理鹽水將斜面上的細菌洗脫下來，加到營養肉湯中于37℃培養24 h到穩定期，再注入經121℃滅菌的離心管中于4 000 r/min下離心10 min，棄掉上清液并用相同體積的PBS清洗離心管底部的沉淀物，再次放入離心機在相同條件下離心，后用10 mL的PBS對細菌進行重懸，試驗時將其稀釋到所需濃度。

1.3 試驗方法

取上述菌懸液1 mL加到盛有100 mL PBS的三角瓶中，加入消毒劑并用磁力攪拌器在400 r/min下進行緩慢攪拌。在預先設定的反應時間分別取出1 mL的水樣加入到9 mL帶有硫代硫酸鈉中和劑的生理鹽水中，稀釋后用平板法進行計數[19]。

在進行溫度影響的試驗時，將盛有試驗溶液的三角瓶放置在恒溫水浴鍋中，調節到試驗所需溫度，待溫度恒定后，再加入消毒劑進行滅菌試驗。

采用甘氨酸和腐植酸分別代表低分子量和高分子量有機物進行試驗。取1 g甘氨酸加入到1 L經滅菌的去離子水中，配制成濃度為1 g/L的儲備液。取1g腐植酸加到1 L經滅菌的去離子水中，使用0.1 mol/L的NaOH調節溶液的pH到12，待腐植酸溶解后，再用0.1 mol/L的HCl調節溶液pH到7.6左右，配制成濃度為1 g/L的儲備液，并測定上述兩種溶液的TOC值。使用時將溶液稀釋到所需濃度。

1.4 數據擬合

數據擬合用Chick－Watson模型：

式中N——反應時間t時的存活細菌數，cfu/mL；

N0——反應時間0時的存活細菌數，cfu/mL；

k——反應速率常數，L/mg·min；

C——反應時間t時的消毒劑濃度，mg/L；

t——反應時間，min。

2 試驗結果與討論

2.1 pH值的影響

pH值對二氧化氯滅活糞腸球菌的影響如圖1所示。

圖1 pH值對二氧化氯滅活糞腸球菌的影響Fig.1 Effect of pH on Inactivation of Enterococcus Faecalis with Chlorine Dioxide

由1圖可知在pH為6～9的范圍內，隨著pH值的增加，滅活速率逐漸變大，達到3log所需的Ct值在pH=9時比pH=6時的少48%。這與pH值對自由氯滅活細菌病毒的情況恰好相反。出現這種情況的原因可能是由于二氧化氯對細菌滅活的機理不同于自由氯，自由氯是溶于水后產生的次氯酸起作用，次氯酸呈酸性，所以低pH條件有利于自由氯滅活，而二氧化氯是通過單質分子的作用對細菌起到滅活效果，高pH值條件下產生的氫氧根離子可能對整個滅活過程起到了催化作用[20]。此外在pH值為7.5～9之間，滅活分為兩個階段：開始快速的滅活期和后期速率較慢的拖尾期。這與先前的研究者們經常觀察到的生存曲線首先是一個指數的動力學接著是存活菌數量恒定或緩慢減少的拖尾現象的情況一致[21]。

2.2 溫度的影響

溫度對二氧化氯滅活糞腸球菌的影響如圖2所示。

圖2 溫度對二氧化氯滅活糞腸球菌的影響Fig.2 Effect of Temperatrue on Inactivation of Enterococcus Faecalis with Chlorine dioxide

由2圖可知隨著溫度的升高，二氧化氯的滅活速率逐漸變大。溫度在由8℃提高到35℃時，達到3log所需的Ct值由 1.8 降低到 0.59 mg·min/L，減少了大約1/3倍。

溫度對滅活速率常數的影響如圖3所示。

圖3 溫度對二氧化氯滅活糞腸球菌反應速率常數的影響Fig.3 Effect of Temperatrue on Rate Constants for Inactivation ofEnterococcus Faecalis with Chlorine Dioxide

根據阿倫尼烏斯公式：

式中：k——反應速率常數，L/mg·min；

A——頻率因子；L/mg·min；

Ea——活化能，J/mol；

R——氣體常數，8.314 J/mol·K；

T——絕對溫度，K。

將滅活速率常數k的自然對數（lnk）與溫度的倒數（1/T）作圖，由最小二乘法得出參數A=1.8×106 L/mg·min，二氧化氯滅活糞腸球菌的活化能Ea=30 396 J/mol，此結果小于臭氧滅活枯草桿菌的Ea=46 820 J/mol值[22]。

2.3 有機物的影響

有機物對二氧化氯滅活糞腸球菌的影響如圖4所示。

圖4 有機物對二氧化氯滅活糞腸球菌的影響Fig.4 Effect of Organic Matters on Inactivation of Enterococcus Faecalis with Chlorine Dioxide

試驗時所投加的甘氨酸和腐植酸的TOC濃度均為0.4 mg/L。由圖4可知當不存在有機物時，二氧化氯對糞腸球菌的滅活規律按照Chick-Watson定律進行。而當存在有機物時，滅活規律表現為一個快速的假一級動力學滅活，達到一定的滅活率時，出現了拖尾現象。投加甘氨酸和腐植酸后，二氧化氯對糞腸球菌的滅活效果明顯下降，達到3log去除率所需的Ct值由1.22分別提高到1.84和3.58 mg·min/L，提高了 51%和近 2 倍。

此外在相同的TOC濃度下，代表大分子量的腐植酸對二氧化氯滅活糞腸球菌的影響大于同濃度下的甘氨酸，分析可能是因為二氧化氯在與大分子量的腐植酸反應時，將其氧化分解為小分子量的中間產物，而二氧化氯還可繼續與這些中間產物反應，直到二氧化氯的剩余濃度為0或者是生成了最終產物為止，從而造成了腐植酸對滅活效果的反作用大于小分子量的甘氨酸。

3 結論

（1）與pH值對自由氯滅活細菌的影響情況恰好相反，隨著pH值的增加，二氧化氯的滅活速率逐漸變大，pH=9時達到3log所需的Ct值比pH=6時的少48%。

（2）在8～35℃范圍內，隨著溫度的升高，二氧化氯的滅活速率逐漸變大。且溫度對滅活速率常數的影響符合阿倫尼烏斯定律。

（3）有機物的加入降低了二氧化氯對糞腸球菌的滅活速率，并且大分子量的腐植酸的的影響要大于小分子量的甘氨酸。

［1］ Shepard BD,Gilmore MS.Antibiotic－resistant enterococci:the mechanisms and dynamics of drug introduction and resistance[J].Microbes Infect,2002,4(2):215－224.

［2］Creti R,Imperi M,Bertuccini L,et al.Survey for virulence determinants among Enterococcus faecalis isolated from different sources[J].Journal of Medical Microbiology,2004,53:13－20.

［3］Murray PR.Manual of Clinical Microbiology[M].6th.Washingtong DC:American Society Microbiology,1995.

［4］ Mandell GL,Bennet t J E,Dolin R.Principles and practice of infectious disease[M].5th.New York:Churchill Livingstone,2000.

［5］GB 5749－2006,生活飲用水衛生標準[S].

［6］Benoit Barbeau,Lina Boulos.Examining the use of aerobic spore－forming bacteria to assess the efficiency of chlorination[J].Water Research,1999,13:2941－2948.

［7］ Corinne Le Dantec,Jean－Pierre Duguet.Chlorine Disinfection of Atypical Mycobacteria Isolated from a Water Distribution System[J].Applied And Environmental Microbiology,2002,3:1025－1032.

［8］David E.Johna,Charles N.Haas.Chlorine and ozone disinfection of Encephalitozoon intestinalis spores[J].Water Research,2005,39:2369－2375.

［9］錢振宇,崔玉杰,等.兩種不同劑型二氧化氯消毒劑飲水消毒效果試驗觀察[J].中國衛生檢驗雜志,2009,19(7):1678－1679.

［10］韓艷淑,陳素良,等.二氧化氯發生器對飲用水消毒效果觀察[J].中國消毒學雜志,2005,22(1):43－45.

［11］代園園,員建,苑宏英,等.二氧化氯作為消毒劑在飲用水處理中的應用[J].凈水技術,2011,30(1):4－7.

［12］鄒啟光,關小紅.二氧化氯取代液氯消毒劑的可行性研究[J].凈水技術,2002,21(3):13－16.

［13］黃君禮.新型水處理劑——二氧化氯技術及其應用[M].北京:化學工業出版社,2002.

［14］黃君禮,吳明松.飲用水二氧化氯消毒技術的現狀[J].凈水技術,2010,29(4):16－18,31.

［15］陳濟民.二氧化氯在消毒領域中的應用前景[J].凈水技術,2003,22(1):15－16.

［16］鄧玉良.二氧化氯的生產和應用評述[J].化學世界,2002,(1):46－49.

［17］王占生,劉文君.我國給水深度處理應用狀況與發展趨勢[J].中國給水排水,2005,21(9):29－33.

［18］姚新梅.二氧化氯消毒技術在貴州農村水廠中的應用[J].貴州大學學報 (自然科學版 ),2009,26(1):134－136.

［19］魯巍,王云,張曉健.飲用水中幾種細菌計數方法的比較[J].環境科學,2004,25(4):167－169.

［20］Kristen M.Ruffell,Jason L.Renneckerm.Inactivation of cryptosporidium oocysts with chlorine dioxide[J].Water Research,2000,3:868－876.

［21］R.Virto,D.Sanz,I.Modeling the effect of initial concentration of Escherichia coli suspensions on their inactivation by chlorine[J].Journal of Food Safety,2005,25:120－129.

［22］Min Cho,Hyenmi Chung,Jeyong Yoon.Quantitative Evaluation of the Synergistic Sequential Inactivation of Bacillus subtilis Spores with Ozone Followed by Chlorine[J].Environ.Sci.Technol.,2003,37:2134－2138.