香葉醇治療小鼠白假絲酵母菌陰道炎的療效研究

代 敏， 彭 成

(1.成都醫學院，四川成都610500;2.成都中醫藥大學中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川成都610075)

白假絲酵母菌Candida albicans俗稱白色念珠菌，常存在于人陰道、腸道、口腔和上呼吸道等。在陰道內，白假絲酵母常和熱帶念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌等其它種屬共同構成陰道的正常菌群［1］，作為陰道內最主要的一個種屬，當陰道內pH值改變或機體防御機能下降時，白假絲酵母會大量增殖，誘發陰道炎［2］。外陰陰道念珠菌病是全球婦女常見的一種感染性疾病［3］，據報道，幾乎75%女性至少經歷一次感染，40%～50%患者有反復發作，嚴重影響婦女的生活和健康［4］。目前常用廣譜抗真菌藥如克霉唑等進行治療，但因抗菌藥的長期使用，白假絲酵母耐藥率不斷增加，發病率不斷增加［5－6］。因此，開發新型天然無毒抗白假絲酵母藥物迫在眉睫。

中藥芳香療法被用于傳統的陰道念珠菌病治療［7］。香葉醇是一種天然的植物源醇，廣泛存在于香茅油、香葉油、香草油、玫瑰油等，作為一種香料成分，廣泛用于建筑裝飾和化妝品、高級香水、洗發水、香皂和其它非化妝品，如家用洗潔精和去污劑，全球使用每年超過1 000噸［8］，現代藥理學研究表明，香葉醇具有抗細菌、抗霉菌、殺蟲、抗腫瘤、逆轉細菌耐藥性和免疫調節［9－13］等廣泛的藥理活性，亦被美國環境保護署認為是最低風險的殺蟲劑［14］。課題組前期研究發現香葉醇還具有殺滅陰道滴蟲和抗多重耐藥細菌等廣譜抗微生物活性。關于香葉醇抗白假絲酵母活性研究方面，目前僅有關于天竺葵油的主要成分香葉醇抑制白假絲酵母菌絲生長和對陰道菌落數影響的報道［7］。本研究擬采用瓊脂平板二倍稀釋法測定香葉醇對白假絲酵母標準株和臨床分離株的最低抑菌濃度，研究其體外活性;體內采用白假絲酵母陰道炎小鼠模型，探討香葉醇對白假絲酵母陰道炎模型小鼠的治愈率和治愈時間，以及對陰道內白假絲酵母生長的影響，結合體內、外活性研究，綜合評價香葉醇在治療白假絲酵母陰道炎的臨床療效，為后續防治白假絲酵母陰道炎及白假絲酵母感染性疾病的新藥——香葉醇的系統研究與開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株 ①白假絲酵母標準株:3株，其中1株購自美國臨床實驗室菌種保藏中心，編號為ATCC14053;2株購自中國工業微生物菌種保藏管理中心，編號分別為CICC32819和CICC31284。

②白假絲酵母臨床分離株:14株，于2011年9月至12月分離于四川省婦幼保健院婦科門診患者的陰道分泌物，并經BIO－KONT公司的KC－16鑒定板條與藥敏紙片鑒定為白假絲酵母。

1.2 藥物 實驗藥物:香葉醇 (購自Sigma公司，批號:MKBH7931V，質量濃度為0.878 g/mL)。

陽性藥物:克霉唑陰道片 (濟南利民制藥有限公司，批號:1108148)。

1.3 實驗動物 小鼠 (SPF級) ［成都中醫藥大學實驗動物研究中心，生產許可證號:SCXK(川)2008－11，使用合格證號:SCXK(川)2008－049］。

1.4 培養基和試劑 沙氏瓊脂培養基 (每升含氯霉素0.1 g/L，廣東環凱微生物科技有限公司)，苯甲酸雌二醇注射液 (天津金耀氨基酸有限公司，批號:1007061)，吐溫－80(成都市科龍化工試劑 廠， 批 號:20080925)，Mcfarland Standard(bioMeriéux，Inc. 批號:821772701)等。

1.5 主要儀器 多點接種儀 (日本佐久間制作所，SAKUMA MIT－P型)，實驗室用高壓滅菌器(SANYO， MLS—3780 型 )， CO2INCUBATOR(SANYO，MOC—15A)，節能凈化工作臺 (成都新光非蘭特凈化工程有限公司)等。

1.6 香葉醇抗白假絲酵母的體外活性

1.6.1 含藥平板的制備 用1%吐溫－80無菌蒸餾水對香葉醇進行倍比稀釋，分別稀釋成1∶2～1∶2 048共11個梯度，在一次性無菌培養皿中分別加入不同梯度的藥液1 mL和14 mL滅菌的沙氏瓊脂培養基，藥物在各平板中的稀釋梯度分別為29.27～28.58μg/mL，充分混勻，干燥后備用，以平板內加入等量1%吐溫－80水代替藥物制備溶劑對照平板，以生理鹽水代替藥物制備陽性對照平板。

1.6.2 菌液配置 將白假絲酵母標準株和臨床分離株用無菌生理鹽水調至菌密度1.5×106CFU/mL。

1.6.3 最低抑菌濃度 (MIC)的測定 用多點接種儀將菌液加入不同梯度的含藥平板、陽性和溶劑對照平板，并以生理鹽水代替菌液作陰性對照。37℃恒溫培養24～48 h，觀察各菌株在平板中的生長情況。

1.6.4 結果判定 以平板內無白假絲酵母生長的藥物最小濃度為此藥對該菌株的最低抑菌濃度。

1.7 香葉醇治療白假絲酵母菌陰道炎的療效

1.7.1 受試菌活化 將白假絲酵母標準株CICC32819接種于沙氏瓊脂培養基，37℃培養24 h，活化后備用。

1.7.2 模型制備 在文獻［15］的基礎上加以改進，并通過預實驗對影響模型建立的各項因素進行優化，確定白假絲酵母菌陰道炎模型小鼠的建立方法。具體方法如下，選取SPF昆明小鼠60只，體質量 (20±2)g，在感染前6 d開始，每只小鼠隔日頸部皮下注射苯甲酸雌二醇0.1 mg，并于最后1次注射苯甲酸雌二醇后，隨機選擇50只小鼠陰道內接種，每只小鼠感染白假絲酵母菌1.5×107CFU，24 h后重復感染1次;另10只以等體積生理鹽水代替菌液作為空白對照。在最后1次感染后48 h和72 h分別取陰道分泌物進行涂片鏡檢，觀察菌絲及芽生孢子生成情況，同時接種陰道分泌物于沙氏瓊脂平板上，37℃培養24～48 h，觀察菌株的生長情況;并觀察陰道分泌物等變化。若在平板中生長有典型的白假絲酵母菌落，顯微鏡下觀察到菌絲及芽生孢子，說明白假絲酵母菌陰道炎模型小鼠制備成功。

1.7.3 實驗分組 待小鼠造模成功后，用0.1 mL無菌生理鹽水對每只小鼠陰道進行無菌沖洗，對沖洗液進行菌落計數，根據小鼠陰道菌落計數結果將小鼠隨機分為5組，即模型組、實驗藥物 (高、中、低)三個劑量組和陽性藥物克霉唑組。未感染的為空白組，每組10只。各組小鼠陰道內白假絲酵母的菌落數情況見表1。

表1 各組小鼠陰道感染白假絲酵母的情況分析Tab.1 Analysis on the colony num ber of Candida albicans in vagina

給藥前，與空白組比較，模型組、陽性藥組和實驗藥組陰道內菌落數明顯增加(P＜0.01)，而模型組和實驗組各組之間均無統計學意義(P＞0.05)。說明白假絲酵母菌陰道炎小鼠模型造模成功，且各組小鼠陰道內感染程度相當。

1.7.4 香葉醇治療白假絲酵母菌陰道炎模型小鼠的療效 采用陰道內給藥法對白假絲酵母菌陰道炎模型小鼠進行治療，即每天分別采用高、中、低三個劑量的香葉醇對感染模型小鼠進行治療，連續20 d。其中陽性藥物組用克霉唑，模型和空白組用生理鹽水。分別在給藥前(0 d)，以及第3天、第5天和第7天給藥6 h后用0.1 mL無菌生理鹽水沖洗陰道，對沖洗液內的白假絲酵母進行菌落計數，分別統計分析給藥前(0 d)、給藥后第3天、第5天和第7天小鼠陰道內菌落數的變化情況，觀察藥物對感染小鼠陰道內白假絲酵母的殺滅或抑制作用。在給藥第7天后每天接種觀察陰道分泌物的菌絲及芽生孢子生長情況以及在沙氏瓊脂平板中的生長情況，同時觀察小鼠陰道分泌物等的變化情況。以連續3 d陰道分泌物接種，無白假絲酵母生長，且陰道無充血、腫脹等臨床癥狀，判定為治愈，治愈小鼠不再用藥。

1.7.5 數據統計分析 采用SPSS 17.0軟件中的單因素方差分析法比較分析各組小鼠陰道內菌落數之間的差異顯著性，用配對T檢驗分析香葉醇各劑量組在給藥前后及不同給藥時間的差異顯著性，統計給藥14 d和給藥20 d的治愈時間和治愈率。

2 結果與分析

2.1 香葉醇抗白假絲酵母的體外活性 采用瓊脂平板二倍稀釋法測定了香葉醇和陽性藥克霉唑對3株白假絲酵母標準株和14株臨床分離株的最低抑菌濃度，結果見表2。

表2 香葉醇對白假絲酵母的體外抗菌活性Tab.2 In vitro anti-Candida albicans activity of geraniol

由上表可知，香葉醇對3株白假絲酵母標準株和14株臨床分離株均有較強的抗菌活性。對3株白假絲酵母標準株和14株臨床陰道炎感染患者分離株的 MIC分別為0.11～0.23 mg/mL、0.11～0.23 mg/mL［MIC均 值 為 (0.19 ± 0.06)mg/mL］。陽性藥克霉唑對1株標準株ATCC14053和2株臨床分離株無明顯抗菌活性，說明克霉唑對部分白假絲酵母產生了一定程度的耐藥性。

2.2 香葉醇治療白假絲酵母菌陰道炎的療效 香葉醇對白假絲酵母菌陰道炎模型小鼠陰道內白假絲酵母生長的影響結果見表3，給藥14 d和給藥20 d的治愈時間和治愈率分析見表3。

表3 香葉醇對白假絲酵母菌陰道炎模型小鼠陰道內菌落數的影響Tab.3 Effect on the colony number of Candida albicans in mice vagina of geraniol

由表3可知，給藥后，與模型組比較，高、中、低劑量組白假絲酵母菌落數明顯下降，且隨著給藥時間的延長，病情逐漸好轉。比較各劑量組給藥前后的菌落數變化情況，與同組內給藥前比較，高劑量組給藥后第3天菌落數顯著降低 (P＜0.05)、第5天和第7天菌落數均極顯著性下降(P＜0.01);中劑量組給藥后第3天菌落數顯著降低 (P＜0.05)，第5天和第7天菌落數均極顯著性下降 (P＜0.01);低劑量組給藥后第3天、第5天和第7天菌落數均極顯著性下降 (P＜0.01)。與給藥后第3天比較，低劑量組給藥后第7天菌落數呈顯著性下降 (P＜0.05)。說明香葉醇高、中、低三個劑量組與陽性藥克霉唑具有相似的體內抗白假絲酵母活性。

表4 香葉醇治療白假絲酵母菌陰道炎的療效Tab.4 Efficacy of geraniol against candidal vaginitis

由表4可知，香葉醇高、中、低劑量組給藥14 d對白假絲酵母菌陰道炎模型小鼠的平均治愈時間分別為11.00 d、11.20 d和12.20 d，治愈率分別為80.00%、80.00%和70.00%;與模型組(平均自愈時間為14.30 d，自愈率為10.00%)比較，高劑量組治愈時間明顯縮短 (P＜0.05)，中、低劑量組治愈率顯著提高;各劑量組內之間比較，治愈時間均無明顯統計學意義，且量效關系不顯著。香葉醇高、中、低劑量組給藥20 d對模型小鼠的平均治愈時間分別為12.00 d、12.10 d和13.00 d，治愈率均為90.00%;與模型組 (平均自愈時間為18.90 d，自愈率為30.00%)比較，三個劑量組治愈時間均明顯縮短 (P＜0.01)，治愈率顯著提高;各劑量組內之間比較，治愈時間均無明顯統計學意義 (P＞0.05)。說明香葉醇具有治療白假絲酵母菌陰道炎作用，在試驗劑量范圍內，量效關系不顯著。

3 討論

念珠菌性陰道炎是育齡婦女常見的條件致病真菌感染，其中約有85%～90%由白色念珠菌引起［16］。在美國，所有外陰、陰道炎疾病中念珠菌性陰道炎發生率最高為39%，是滴蟲性陰道炎的4倍［17］。近年來，隨著抗生素及皮質激素藥物的廣泛應用，我國白假絲酵母菌陰道炎發病率呈明顯上升趨勢，嚴重影響婦女的工作及性生活［16－17］。為了探討抗真菌中藥治療白假絲酵母菌陰道炎的療效，本研究首次對香葉醇在體外對白假絲酵母的最低抑菌濃度進行了測定，結果表明香葉醇對17株白假絲酵母受試菌株均有較強的抗真菌活性，其中對來自臨床陰道炎感染患者分離株的MIC為0.11～0.23 mg/mL，雖然低于廣譜抗真菌陽性藥克霉唑對多數白假絲酵母分離株的體外抗真菌活性(MIC為0.81～26.04μg/mL)，但研究發現克霉唑對受試菌株中的1株標準株和2株臨床分離株在最大濃度1.67 mg/mL時無抗菌活性，說明部分白假絲酵母菌株對克霉唑產生了一定程度的耐藥性。因此，香葉醇除本身具有較強的自身體外抗菌活性之外，還具有克霉唑等陽性藥所不可比擬的優勢，一方面香葉醇對所有受試菌均有較強抗真菌活性，無耐藥菌株;另一方面香葉醇廣泛存在于多種植物中，作為天然物質，具有毒副作用小和明顯的自然資源優勢。

目前，中藥在抗感染性疾病的研究方面主要集中于體外研究，體內整體療效研究相對較少。鑒于機體感染不僅受外界環境因素的影響，還受體內諸多因素的影響，因此，本研究以“藥物 (香葉醇)—機體 (模型小鼠)—微生物 (白假絲酵母)”的整體觀和系統觀為指導思想，綜合分析了藥物、機體和微生物這三者之間的相互作用，為系統、科學評價香葉醇在未來抗感染性疾病中的開發和運用奠定基礎。首先，借助于小鼠外陰陰道感染白假絲酵母制備念珠菌陰道炎感染模型，探討機體和微生物之間的相互作用，選擇外源性雌激素造成小鼠假發情狀態，能明顯增強小鼠對白假絲酵母的易感性，小鼠陰道感染率可達100.00%，且感染小鼠的陰道內菌落數計數在整個觀察期中一直保持較高水平，亦證明本實驗白假絲酵母菌陰道炎模型小鼠制備成功。其次，利用白假絲酵母菌陰道炎模型小鼠，通過陰道內給藥，且每給藥2 d后用生理鹽水沖洗陰道對陰道內的白假絲酵母進行菌落計數，分析了藥物香葉醇對感染機體內微生物的作用。結果表明，與模型組和給藥前比較，隨著給藥時間的延長，病情逐漸好轉，菌落數明顯下降(P＜0.05，P＜0.01)。最后，結合中藥自身藥效相對較慢的特點和預實驗結果，分別選擇了用藥14 d和20 d，根據小鼠陰道內微生物轉陰率、陰道分泌物變化等情況綜合分析香葉醇對微生物和機體的相互作用，確定小鼠的治愈率和治愈時間。結果表明，給藥14 d后，高、中、低劑量小鼠的治愈時間分別為11.00 d，11.20 d和12.20 d，治愈率分別為80.00%、80.00%和70.00%，明顯低于模型組的自愈時間 (14.30 d)，高于模型組的自愈率(10.00%)。給藥20 d后，高、中、低劑量組小鼠的治愈時間分別為12.00 d、12.10 d和13.00 d，治愈率均為90.00%，均明顯低于模型組自愈時間18.90 d(P＜0.01)，明顯高于模型組的自愈率(30.00%)。比較高、中、低三個劑量組的治愈率和治愈時間，發現三者均無明顯統計學差異，說明在給定的劑量范圍內，量效關系不顯著，提示使用低劑量治療白假絲酵母陰道炎，即可達到較好的臨床療效。

此外，本研究還發現香葉醇在高、中、低三個劑量范圍內對小鼠陰道均無明顯局部刺激性和毒副作用，說明香葉醇在治療白假絲酵母菌陰道炎是相對安全、有效的，亦有報道香葉醇可能導致過敏性接觸性皮炎［18－19］，對于香葉醇的其它毒副作用有待于后續深入研究。課題組前期研究還發現香葉醇除具有自身的抗真菌活性外，還兼有具抗多重耐藥菌如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和抗滴蟲等多種藥理活性，說明香葉醇具有治療真菌性、細菌性和滴蟲性陰道炎的聯合療效，更符合常以混合感染性陰道炎的臨床實際。因此，香葉醇具有運用于治療白假絲酵母菌陰道炎、滴蟲性陰道炎、細菌性陰道炎的開發和運用前景，尤其是在治療由耐藥菌株和蟲株引起的陰道炎等感染性疾病方面具有重要的理論和現實意義。

［1］Resende J C，de Resende M A，Saliba JL.Prevalence of Candida spp.in hospitalized patients and their risk factors［J］.Mycoses，2002，45(8):306－312.

［2］Candido R C，Toloi M R，Franceschini SA，et al．In vitro activity of antimycotic agents determined by E－test method against vaginal Candida species［J］.Mycopathologia，1999，144(1):15－20.

［3］Mahmoudi Rad M，Zafarghandi S，Abbasabadi B，et al．The epidemiology of Candida species associated with vulvovaginal candidiasis in an Iranian patient population［J］.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2011，155(2):199－203.

［4］Asticcioli S，Sacco L，Daturi R，et al.Trends in frequency and in vitro antifungal susceptibility patterns of Candida isolates from women attending the STD outpatients clinic of a tertiary care hospital in Northern Italy during the years 2002—2007［J］.New Microbiol，2009，32(2):199－204.

［5］Yücesoy M，Marol S.Performance of chromagar Candida and biggy agar for identification of yeast species［J］.Ann Clin Microbiol Antimicrob，2003，2:8.

［6］Sendid B，Francois N，Standaert A，et al．Prospective evaluation of the new chromogenic medium Candi Select 4 for differentiation and presumptive identification of the major pathogenic Candida species［J］.J Med Microbiol，2007，56:495－9.

［7］Maruyama N，Takizawa T，Ishibashi H，et al．Protective activity of geranium oil and its component，geraniol，in combination with vaginal washing against vaginal candidiasis in mice［J］.Biol Pharm Bull，2008，31(8):1501-1506．

［8］Lapczynski A，Bhatia S P，Foxenberg R J，et al．Fragrance material review on geraniol［J］.Food Chem Toxicol，2008，46(11):S160－170.

［9］Mendon?a－Ade L，da－Silva C E，de－Mesquita F L，et al．Antimicrobial activities of components of the glandular secretions of leaf cutting ants of the genus Atta［J］.Antonie Van Leeuwenhoek，2009，95(4):295－303.

［10］余伯良，羅惠波，周 健，等.山蒼子油抗霉菌及抑制黃曲霉產毒的有效成分研究［J］.四川輕化工學院學報，2002，15(1):32－36.

［11］Barros L A，Yamanaka A R，Silva L E，et al．In vitro larvicidal activity of geraniol and citronellal against Contracaecum sp(Nematoda:Anisakidae)［J］.Braz J Med Biol Res，2009，42(10):918－920.

［12］Lorenzi V，Muselli A，Bernardini A F，et al．Geraniol restores antibiotic activities against multidrug－resistant isolates from gram－negative species［J］.Antimicrob Agents Chemother，2009，53(5):2209－2211.

［13］Tiwari M，Kakkar P.Plant derived antioxidants－Geraniol and camphene protect rat alveolar macrophages against t－BHP induced oxidative stress［J］.Toxicol In Vitro，2009，23(2):295－301.

［14］Reeves W K，Miller M M.Aqueous 2%geraniol as a mosquito repellent failed against Aedes aegypti on ponies［J］.J Am Mosq Control Assoc，2010，26(3):340－341.

［15］劉麗芬，柴天川.扶正方藥對復發性念珠菌性陰道炎小鼠模型的抗真菌作用研究［J］.時珍國醫國藥，2009，20(3):535－536.

［16］譚 娟，曹 菲，丁 娟，等.不同條件下小鼠白念珠菌性陰道炎易感性的研究［J］.華中醫學雜志，2005，29(3):149－150.

［17］陳善娟，劉志香，吳 艷，等.不同抗真菌藥治療白念珠菌性陰道炎模型小鼠的療效比較［J］.醫藥導報，2006，25(12):1246－1249.

［18］Tamagawa－Mineoka R，Katoh N，Kishimoto S.Allergic contact cheilitis due to geraniol in food［J］.Contact Dermatitis，2007，56(4):242－243.

［19］Reeves W K，Miller M M.Aqueous 2%geraniol as a mosquito repellent failed against Aedes aegypti on ponies［J］.J Am Mosq Control Assoc，2010，26(3):340－341.