小白菊內酯抗腫瘤作用機制研究進展

徐惠君， 佟仲生*， 賈勇圣， 陳 悅

(1.天津醫科大學附屬腫瘤醫院乳腺腫瘤內科，乳腺癌防治教育部重點實驗室天津市腫瘤防治重點實驗室，天津300060;2.南開大學藥學院，天津300071)

小白菊內酯 (Parthenolide)是中藥野生甘菊 (銀膠菊屬銀膠菊Parthenium hysterophorus)的主要提取成分，它是倍半萜烯內酯的主要成分［1］。小白菊內酯的分子式為C15H20O3(化學結構式見圖1)，相對分子質量為248.3，小白菊內酯含有α－亞甲基－γ－內酯環和環氧化物結構［2］，這些結構可以和含有巰基基團的酶和其它功能蛋白反應，干擾細胞的許多關鍵生物過程，如細胞的信號傳導途徑，線粒體呼吸，增殖和凋亡等［3］。這些反應可降低酶的活性，改變谷胱甘肽 (GSH)的代謝并引起細胞內氧化還原平衡狀態的嚴重失衡。小白菊內酯的環氧亞甲基結構使其具有細胞毒性。

圖1 小白菊內酯的化學結構

小白菊內酯傳統上主要用來治療偏頭痛、發熱和類風濕性關節炎等［4］。近年來研究發現小白菊內酯在多種腫瘤中發揮抗癌作用，如乳腺癌、膽管癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、白血病、黑色素瘤和神經元［1，5－10］等，并成為研究的一個重要熱點。許多研究發現小白菊內酯發揮抗腫瘤作用主要通過靶向作用于核轉錄因子－κB(NF－κB)［11］，產生活性氧(ROS)［2］，和活化c－Jun氨基端激酶(JNK)［12］等。

腫瘤細胞對化療藥物產生耐藥性，成為目前治療失敗的重要原因，Gao等研究發現小白菊內酯可以增強發生耐藥的腫瘤細胞對化療藥物的敏感性［13］，并且Zuch等研究發現小白菊內酯可以增加腫瘤細胞對放療的敏感性［14］。這些結果使得小白菊內酯有望成為一種新的抗腫瘤藥物。本文就小白菊內酯在抗腫瘤作用中的機制進行綜述，以期進一步推動小白菊內酯在抗腫瘤作用中的研究和應用。

1 抑制NF-κB的信號通路

NF－κB是Rel/NF－κB轉錄因子家族可誘導的二聚化轉錄因子，主要由P50和P65兩個多肽亞基構成。NF－κB在惡性腫瘤中起著重要的作用，主要包括控制凋亡，細胞增殖和分化，促進腫瘤細胞生存等［15］。NF－κB的活性受到多種水平的調節［16－19］。在多數種類的細胞中，NF－κB 由于被κB的抑制劑IκB抑制，在細胞質中以非活性的形式存在，直到受到相關的刺激作用而激活。細胞受到刺激后IκB激酶復合物(IκC)，包括IκKα，IκK?，和IκKy［20］，使 IκB磷酸化，進而發揮作用［21］。小白菊內酯對IκC的作用目前仍有些爭議。Zhang等認為小白菊內酯可特異性地抑制IκK絡合物的活性，序貫降解NF－κB抑制蛋白［20］。小白菊內酯二甲氨基類似物 (DMAPT)，它能抑制 NF－κ?［9］，主要是IκK?，達到抗腫瘤作用。此外，Zuch等研究發現小白菊內酯對NF－κB途徑誘導的細胞死亡依賴JNK的活化［14］。小白菊內酯抑制NF－κB的傳導途徑也可能通過對其他關鍵信號分子抑制完成的，如 P53［18］和環氧化酶－2(COX2)［19］等。并且，Sugiyasu等研究發現小白菊內酯可以通過抑制NF－κB信號通路，使得產生抵抗的腫瘤細胞對放療敏感［22］。

2 抑制STATs活性

信號傳導子及轉錄激活子 (STAT)蛋白是介導多種生物學作用 (細胞增殖、血管形成、細胞生存等)的胞外配體反應的轉錄因子［23］。目前，哺乳動物中已識別的STATs有 7 種:STAT－1， STAT－2，STAT－3， STAT－4， STAT－5a，STAT－5b和 STAT－6。STATs受到細胞因子或生長因子刺激發生二聚化作用，接著使酪氨酸磷酸化，并與DNA的特異位點結合調節基因。許多酪氨酸激酶，包括JAKs，TYKs，PTKs和其他非RTKs等可以使STATs磷酸化。正常細胞中，STATs的磷酸化是短暫的，持續時間約30 min至幾個小時，在許多腫瘤細胞系中，STATs，尤其STAT3，發生持續的酪氨酸磷酸化，是由于解除STATs激活的陽性效應物，如其上游的酪氨酸激酶 (TYK)，或抑制STATs磷酸化的負性調節，如磷酸酶，細胞因子信號抑制劑 (SOCS)或活化的STATs蛋白抑制劑 (PIAS)［24］。STATs調節基因轉錄產物B淋巴細胞瘤－x基因 (Bcl－x)和存活素。這些產物使細胞增殖，抑制凋亡［25］。此外，小白菊內酯對STAT3結合的抑制可能抑制Tyr705磷酸化，使得STATs去磷酸化，不能形成二聚體，從而難以到達胞核中發揮生物學作用［26］。腫瘤壞死因子 (TNF)家族成員之一腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體 (TRAIL)，誘導細胞表面受體 TNF－αR1和TNF－αR2發生三聚化，并與其結合，誘導細胞凋亡。Ivanov等研究發現STAT3的一個結合位點位于TRAIL－R2的啟動區，而STAT3可能是TRAIL－R2的負性調節劑［27］。Carlisi等也通過研究發現小白菊內酯能明顯降低STAT3和STAT5的磷酸化，使肝細胞對凋亡更加敏感。通過STAT3 siRNA下調STAT3，明顯增加小白菊內酯對死亡受體的作用［26］。IL－4也是介導STATs信號途徑的細胞因子，它刺激內皮細胞的STAT－6依賴的基因轉錄。在IL－4處理的細胞中，小白菊內酯抑制DNA結合的STAT－6活性，同時小白菊內酯抑制IL－4驅動的一種熒光素酶。該酶受STAT－6反應成分的控制［15］。此外Legendre等在關節軟骨細胞中使用小白菊內酯作為STAT－1和STAT－3的抑制劑，證實了小白菊內酯對STATs活性的抑制［28］。

3 小白菊內酯介導的氧化應激作用及其對線粒體活性的影響

氧化應激指機體在遭受各種有害刺激時，體內ROS產生增多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系統和抗氧化系統失衡，從而引起組織損傷。細胞內的氧化還原狀態在氧化應激和內源性巰基緩沖系統間存在著極精確的平衡，該緩沖系統包括許多非蛋白的低分子量分子，如GSH和一些硫氧還原蛋白的巰基［15］。胞內的氧化還原狀態，在細胞生存和死亡中起著重要的作用。許多化療藥物作為凋亡誘導劑，是因為它們可以減少細胞內的巰基緩沖系統，并且破壞氧化平衡狀態［15］。細胞內不平衡的氧化還原狀態可引發下游的細胞事件，如改變線粒體功能和細胞信號傳導途徑，都將引起凋亡細胞死亡。在前列腺癌細胞中，小白菊內酯可通過活化NADPH氧化酶產生ROS［29］。線粒體呼吸鏈是細胞內ROS產生的位置，并經常受到氧化應激的影響［21］。小白菊內酯可以通過調節氧化還原平衡狀態，耗竭細胞內的GSH和蛋白巰基，從而使細胞死亡，達到抗腫瘤作用。此外，小白菊內酯能明顯增加細胞內的ROS產生和胞漿中的鈣水平。線粒體呼吸鏈是胞內ROS產生的主要位點，線粒體的完整性或功能受到破壞都會引起氧化應激。小白菊內酯通過活化caspases級聯系統，降低線粒體膜電勢，釋放線粒體前凋亡蛋白，如人細胞色素C，半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶激活劑/家族直接結合蛋白等［28］，從而影響線粒體功能，引起氧化應激。截短型BH3結構域相互作用促凋亡蛋白 (tBid)的前凋亡活性和其它B淋巴細胞瘤－2基因 (Bcl－2)家族成員密切相關，所有Bcl－2家族可引起線粒體功能障礙，誘導凋亡。小白菊內酯通過caspase8途徑使BH3結構域相互作用促凋亡蛋白 (Bid)逐步裂解成tBid蛋白，誘導線粒體細胞死亡［15］。

4 維持JNK活性

JNK、蛋白激酶 (ERKs)、P38構成絲裂原活化蛋白激酶 (MAPK)［30］。在活化環中所有的MAPKs被蘇氨酸和酪氨酸雙磷酸化激活，并進入核內磷酸化靶向轉錄因子，如c－Jun［15］。JNK 是 DNA 結合的 NF－κB 的獨立的抑制劑并可以產生 ROS［31］，最終使細胞凋亡。然而 Kennedy等發現JNK在細胞中有著不同的作用:JNK一過性活化具有抗凋亡作用;JNK持續活化具有凋亡前作用。并且JNK的持續活化部分被NF－κB控制。小白菊內酯能活化JNK和抑制NF－κB。并且小白菊內酯通過JNK途徑對細胞增殖的抑制與細胞類型有關。甚至Saadane等認為小白菊內酯的主要作用是活化JNK，且活化JNK所需的小白菊內酯濃度與細胞中NF－κB水平有關［32］。此外 Nakshatri等通過實驗證實小白菊內酯通過JNK途徑誘導的細胞死亡依賴于細胞對腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體 (TRAIL)的敏感性［30］。綜上，小白菊內酯通過多種途徑活化JNK。

5 調節DNA甲基化作用

5＇－半胱氨酸－鳥氨酸 (5＇－CpG)島的超甲基化使腫瘤抑制基因沉默。DNA甲基化抑制劑可調節DNA甲基化，促進癌細胞分化和凋亡，這已成為化療的一個新策略［33］。啟動區的5＇－CpG序列的半胱氨酸DNA甲基化作用是控制基因轉錄、基因組穩定和遺傳銘記的表觀遺傳學機制［31］。DNA甲基轉移酶 (DNMTs)調節此過程的DNA甲基化作用。S－腺苷－甲硫氨酸 (SAM)作為甲基供體在C－5位置為半胱氨酸殘基提供甲基形成5－甲基半胱氨酸［31］。DNA甲基化之前，半胱氨酸從DNA雙螺旋“溢出”形成過度狀態，它和具有催化作用的Cys1226的巰基一起使?去除后在DNMT1催化位點引起4，5烯胺的活化，?去除可以釋放DNMT1和5－甲基半胱氨酸。小白菊內酯對細胞的低甲基化作用主要有:小白菊內酯的γ－亞甲基內酯環通過烷基化反應中的Cys1226巰基的催化結構域硫醇鹽抑制DNMT1;使G1期細胞靜息或干擾轉錄因子Sp1與DNMT1啟動區結合，下調DNMT1表達［33］。異常表觀遺傳學的病人對于目前的DNA甲基化抑制劑無反應，小白菊內酯的研究給予希望，這對于其他以DNMT活性為特點的實體瘤和非增殖性癌癥的治療可能有了新的突破口。

6 促進鼠雙微體2(MDM 2)的泛素化

MDM2屬于一類含有泛素 (ubiquitin)酶配體環指域的蛋白質，泛素配體可以介導蛋白酶體對蛋白質的降解作用及對蛋白酶體本身的降解作用。MDM2最重要的底物是P53，P53作為一種腫瘤抑制蛋白，是許多信號途徑的關鍵節點［34］。P53的失活可引起MDM2在一些腫瘤細胞中過度表達，MDM2的過度表達與癌癥的轉移和復發有關，它是遠處轉移的重要風險因子，并和病人的預后差有關，MDM2的過度表達還可負向調節E黏附蛋白，使癌癥進展和轉移。P53能控制細胞周期的進展和凋亡。MDM2和P53屬于一種反饋調節環的一部分，在許多腫瘤細胞中，該環受到破壞，因而這種反饋調節成為研究抗癌藥物的靶向目標［34］。P53主要受MDM2腫瘤蛋白的負反饋機制調節，升高P53可以降低MDM2的表達，MDM2使P53隔絕和泛素化，進而被蛋白酶體降解，最終從細胞核去除。雖然MDM2對P53水平嚴密監控，但絲氨酸/蘇氨酸激酶和毛細血管擴張性共濟失調突變基因 (ATM)使P53的－NH3端磷酸化，降低MDM2對P53的作用，因而增加了P53穩定性。但P53的—COOH端的乙酰化轉移酶P300/CB Phe P/CAF對P53的乙酰化作用促進P53的轉錄活性［34］。MDM2使賴氨酸去乙酰化酶HDAC1結合到P53－MDM2復合物上，使P53去乙酰化并促進MDM2介導的泛素化作用［34］。小白菊內酯通過重組人組蛋白去乙酰化酶－1(HDAC1)泛素化和蛋白酶體降解機制消耗細胞內HDAC1蛋白，HDAC1蛋白的丟失增加組織蛋白H3的乙酰化作用并活化腫瘤抑制蛋白P21［35］。有趣的是，雖然P53是P21的一種轉錄活化因子，P21增加需要ATM卻不需要P53。小白菊內酯處理的細胞以ATM依賴的方式誘導MDM2泛素化和對蛋白酶的降解，與HDAC1非常相似，并導致P53活化及下游凋亡和細胞周期控制蛋白的活化。小白菊內酯可引出和維持ATM活性，甚至在ATM很少的情況下［34］。

小白菊內酯主要抗腫瘤作用機制為抑制 NF－κB和STAT3的信號通路、氧化應激作用、調節線粒體活性、維持JNK活性、調節DNA甲基化、和促進MDM2的泛素化。小白菊內酯在不同腫瘤中通過多種作用機制發揮抗癌作用，并且這些機制相互影響，相互制約。盡管小白菊內酯在體外實驗表現出許多抗腫瘤效應，但其在體內由于低溶解性而表現出弱的活性。最近合成的小白菊內酯二甲氨基類似物DMAPT，可以改善小白菊內酯的溶解性和生物利用度［21］，并已在體外成功用來根治急性髓細胞白血病干細胞［36］，以及前列腺癌［2］，肺癌和膀胱癌細胞［12］等。此外，小白菊內酯對正常細胞具有較低的毒副作用。這些結果都表明小白菊內酯有望成為一種嶄新的抗腫瘤藥物。小白菊內酯藥理作用的研究仍不是十分透徹，需進一步研究。

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