HPLC程序波長法測定牛黃上清丸中黃芩苷、連翹苷和鹽酸小檗堿

牟英迪， 林吉茂

(1．濟南市食品藥品檢驗所，山東濟南250001;2．山東大學化學與化工學院，山東濟南250100)

牛黃上清丸屬于國家基本藥物目錄品種，具有清熱瀉火、散風止痛的功效。其中牛黃上清丸由全粉入藥，已應用于臨床多年，其標準收載于《中國藥典》2010年版［1］。牛黃上清丸中，連翹具有涼散風熱，清熱解毒的功效，其指標成分為連翹苷［2］;黃芩、黃連、黃柏，具有苦寒的性味，都以清熱瀉火解毒的功效著稱。根據中醫理論，復方中藥藥效的效果是各味藥材多種組分共同作用的結果，各成分的含有量多少及比例關系都會影響整體藥效，影響治療效果［3］。牛黃上清丸由十九味中藥組成，而在《中國藥典》2010年版一部中，在含量測定項下僅對黃芩苷進行測定。同時測定黃芩苷、連翹苷和鹽酸小檗堿的量能更好地表征牛黃上清丸的質量。HPLC程序波長法具有測定誤差小特點，已得到廣泛應用［4-7］。本實驗采用HPLC程序波長法同時測定牛黃上清丸中黃芩苷、連翹苷和鹽酸小檗堿量，可以節約能源，并有效提高檢測效能，減少分析誤差，以期控制其質量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 安捷倫高效液相色譜儀Agilent1200，VWD檢測器;UV—2550型紫外-可見分光光度計(島津);梅特勒AE—240型電子分析天平 (十萬分之一);SK2200LH超聲波清洗器 (上海科導超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 甲醇、乙腈 (天津四友生物醫學技術開發公司，色譜純);水為重蒸餾水;其余試劑均為分析純;黃芩苷 (批號 110715-200514，純度94.0%)、連翹苷 (批號 110821-200711，純度98.9%)和鹽酸小檗堿 (批號110713-200208，純度86.8%)均為中國藥品生物制品檢定所提供。黃連上清丸 (同仁堂股份公司制藥廠，批號為:2015274、2015207、2015049)。

2 實驗方法與結果

2.1 色譜條件 Zorbax XDB-C18色譜柱 (5μm，250 mm×4.6 mm)，以乙腈 (A)-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液 (B)為流動相按表1進行梯度洗脫，流動相體積流量1.0 mL/min，柱溫25℃;進樣量5μL;程序可變檢測波長為0～10 min為278 nm，10～20 min為 230 nm，20～55 min為265 nm。

表1 流動相梯度程序Tab.1 M obile phase gradient elution program

在此檢測條件下，黃芩苷、連翹苷、鹽酸小檗堿均得到較好分離，理論塔板數按黃芩苷計算不低于5 300、按連翹苷計算不低于8 100、按鹽酸小檗堿計算不低于3 200。

2.2 對照品溶液的制備

2.2.1 黃芩苷 精密稱取黃芩苷對照品11.91 mg(純度94.0%)置50 mL量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，搖勻，配制成質量濃度為223.9μg/mL的黃芩苷對照品貯備溶液。

2.2.2 連翹苷 精密稱取連翹苷對照品9.00 mg(純度98.9%)置100 mL量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，搖勻，配制成質量濃度為89.01 μg/mL的連翹苷對照品貯備溶液。

2.2.3 鹽酸小檗堿 精密稱取鹽酸小檗堿對照品9.42 mg(純度86.8%)置100 mL量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，搖勻，配制成質量濃度為81.77μg/mL的鹽酸小檗堿對照品貯備溶液。

精密量取黃芩苷對照品貯備溶液、連翹苷對照品貯備溶液和鹽酸小檗堿對照品貯備溶液4 mL，分別置于25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，按2.1項下的色譜條件測定，得到黃芩苷、連翹苷和鹽酸小檗堿對照品HPLC圖，見圖1。

圖1 對照品HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of reference substances

2.3 供試品溶液的制備 將牛黃上清丸大蜜丸剪碎，稱取1.0 g置蒸餾瓶中，精密加稀乙醇50 mL，稱定質量，超聲處理30 min，置水浴上回流3 h，放冷，稱定質量，用稀乙醇補充丟失的溶劑量，靜置，取上清液，即得供試品溶液。按2.1項下的色譜條件測定，得到牛黃上清丸樣品HPLC圖，見圖2。

圖2 牛黃上清丸樣品HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatogram of Niuhuang Shangqing Pills sam ple solution

2.4 陰性對照溶液的制備 按處方配比，制備不含黃芩、連翹、黃連和黃柏的陰性對照，按2.3項下方法，制得陰性對照溶液并按2.1項下的色譜條件測定，結果陰性對照無干擾，見圖3。

圖3 陰性對照溶液HPLC圖譜Fig.3 HPLC chrom atogram of blank sam p le solution

2.5 標準曲線的繪制 分別精密量取黃芩苷對照品貯備溶液、連翹苷對照品貯備溶液和鹽酸小檗堿對照品貯備溶液1、2、4、6、8 mL，分別置于25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，按上述色譜條件測定，記錄保留時間和峰面積，以質量濃度C與其相應的峰面積A求得回歸方程與相關系數。結果黃芩苷的線性方程為A=3 286.7C+107.12，r2=0.998 9，黃芩苷在8.956～71.65μg/mL范圍內呈良好的線性關系;連翹苷的線性方程為A=899.2C+543.52，r2=0.999 2，連翹苷在14.242～113.93μg/mL范圍內呈良好的線性關系;鹽酸小檗堿的線性方程為A=3 250.20C+212.6，R2=0.998 2，鹽酸小檗堿在3.270～26.17μg/mL范圍內呈良好的線性關系。

2.6 精密度試驗 精取黃芩苷對照品貯備溶液、連翹苷對照品貯備溶液與鹽酸小檗堿對照品貯備溶液各6 mL置同一25 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，得到黃芩苷、連翹苷和鹽酸小檗堿的混合對照品溶液，進行精密度試驗，重復進樣6次 (n=6)，黃芩苷峰面積RSD為0.83%;連翹苷峰面積RSD為0.56%;鹽酸小檗堿峰面積RSD為1.2%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗 精密量取牛黃上清丸同一批號(2015207)供試品溶液5μL，分別于配制后0、2、6、12、24 h后進樣測定，觀察供試品溶液穩定性，樣品中黃芩苷、連翹苷和鹽酸小檗堿的峰面積積分值基本穩定不變，黃芩苷、連翹苷和鹽酸小檗堿峰面積的RSD分別為0.72%、0.63%和0.86%，表明樣品溶液在24 h內穩定性良好。

2.8 重復性實驗 按2.3項下所用方法配制同一批次 (2015274)供試品溶液6份，按2.1項下色譜條件記錄峰面積。測得樣品中黃芩苷平均質量分數為2.93 mg/g，RSD為0.68%;連翹苷平均質量分數為3.33 mg/g，RSD為0.52%;鹽酸小檗堿峰平均質量分數為0.63 mg/g，RSD為0.82%，結果表明測定方法重復性良好。

2.9 回收率試驗 采用加樣回收率法。取已知含有量的同一批次 (2015274)樣品6份，每份約0.5 g，精密稱定，分別加入質量濃度為223.9 μg/mL的黃芩苷對照品貯備溶液、質量濃度為356.04μg/mL的連翹苷對照品貯備溶液和質量濃度為81.77μg/mL的鹽酸小檗堿對照品貯備溶液各適量，按2.3項下方法制備供試品溶液并進行測定，試驗結果表明該方法回收性良好。見表2。

表2 回收率試驗結果 (n=6)Tab.2 Results of recovery tests(n=6)

2.10 檢測限 以色譜峰峰高為基線噪音3倍計算，黃芩苷、連翹苷、鹽酸小檗堿的最低檢測質量濃度分別為0.8、0.16、0.03μg/mL，滿足分析方法的要求。

2.11 定量限 以色譜峰峰高為基線噪音10倍計算，黃芩苷、連翹苷、鹽酸小檗堿的最低檢測質量濃度分別為2.6、0.53、0.1μg/mL，滿足分析方法的要求。

2.12 樣品測定 取牛黃上清丸樣品3批，按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件測定黃芩苷、連翹苷和鹽酸小檗堿的量，結果見表3。

表3 黃芩苷、連翹苷和鹽酸小檗堿的量 (n=3)Tab.3 Contents of baicalin，phillyrin and berberine hydrochloride(n=3)

3 討論

3.1 檢測成分的選擇 在牛黃上清丸中，連翹為臣藥具有涼散風熱，清熱解毒的功效，其指標成分為連翹苷［8］。而黃芩、黃連與黃柏同為佐藥，俗稱“三黃”，善清三焦之火［9］。其中黃芩的有效成分為黃芩苷，黃連與黃柏中的有效成分為小檗堿(通常以鹽酸小檗堿計)［10-11］。尚未有文獻測定牛黃上清丸中的連翹苷，也未有文獻報道采用程序可變波長HPLC法同時測定黃芩苷、連翹苷、鹽酸小檗堿的量。因此選擇牛黃上清丸中4種藥材的3種指標成分建立定量測定方法，用于表征和評價牛黃上清丸的質量。

3.2 檢測波長的選擇 為保證各指標成分均有適宜的靈敏度，取黃芩苷對照品溶液與鹽酸小檗堿對照品溶液在200～400 nm波長處進行掃描，黃芩苷在278 nm、316 nm波長處有最大吸收;連翹苷在230 nm的波長處有最大吸收;鹽酸小檗堿在235 nm、265 nm與345 nm波長處有最大吸收。采用程序可變檢測波長法，分別在其最大吸收波長處(278 nm與265 nm)，用高效液相色譜儀對黃芩苷、連翹苷與鹽酸小檗堿進行梯度洗脫，實驗結果表明黃芩苷、連翹苷與鹽酸小檗堿的回收率良好。

3.3 流動相與與洗脫梯度的選擇 牛黃上清丸為中藥復方制劑，有效成分眾多，且黃芩苷、連翹苷與鹽酸小檗堿的化學性質差異較大，采用等度洗脫所獲得的色譜分離效果不理想，要使各峰達到基線分離須采用二元梯度洗脫。在試驗中采用了多種洗脫方法，如用甲醇-水-磷酸 (40∶60∶0.2)為流動相［1］，發現黃芩苷與連翹苷峰型較好，但鹽酸小檗堿拖尾嚴重，分析其原因，鹽酸小檗堿為季銨堿 (pKa=11.5)，在流動相中主要以陽離子形式存在，易與固定相中酸性硅羥基結合而較難洗脫，形成拖尾。當在流動相中加入適量十二烷基磺酸鈉后，鹽酸小檗堿的保留時間明顯縮短，峰形也得到改善;但柱平衡時間長，而且分析物保留時間不穩定［12-15］。實驗中發現在流動相中加入磷酸二氫鉀溶液保留時間更穩定，因此改用乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液，用此方法洗脫，峰型漂亮，分離度好，重復性佳。

3.4 耐用性試驗 分別用色譜柱Zorbax XDB-C18、Diamaisl C18(250 mm×4.6 mm，5μm)在兩臺高效液相色譜儀 (Agilent1200、島津)進行了耐用性試驗考察，結果表明，選用的2個廠家的儀器和兩種色譜柱均可滿足測定要求。

本實驗以HPLC程序可變波長法同時測定牛黃上清丸中黃芩苷、連翹苷和鹽酸小檗堿的量，方法簡便，靈敏度高，重復性好，在有效測定黃芩苷含有量的同時也對連翹中的指標成分連翹苷、黃柏與黃連中指標成分鹽酸小檗堿的量進行測定，更有利于牛黃上清丸質量控制，可為制定牛黃上清丸質量標準及產品質量控制提供科學的依據。

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