Klebsiella sp.B－36的分離鑒定及產脂肪酶特性研究

惠 明 張開平，2 田 青 高春媛

(河南工業大學生物工程學院1，鄭州 450001)

(百色學院2，百色 533000)

脂肪酶(EC3.1.1.3)又稱三酰基甘油水解酶，是繼蛋白酶和糖化酶之后的第三大類酶［1］，是一類可催化長鏈脂肪酸甘油酯分解成甘油和長鏈脂肪酸的生物催化劑，也可以催化該反應的逆反應［2］。脂肪酶廣泛存在于動物、植物和微生物中，其中微生物來源脂肪酶極其豐富，具有比動植物源脂肪酶更寬的作用pH和作用溫度范圍，便于工業化生產獲得高純度酶制劑［3］。近年來，國內外很多學者對脂肪酶耐高溫、耐酸等特性提出了新的要求，并且已成為一個新的研究熱點，但耐高溫、耐酸性脂肪酶產生菌的培養條件十分苛刻，脂肪酶的獲得非常困難，相關研究論文并不多見［4－6］。針對脂肪酶在工業應用中的特殊酶學性質需求，尋找性能優良的耐熱、耐酸以及符合現代生物工程需求的產脂肪酶菌株是脂肪酶應用研究開發的基礎，因此，獲得耐高溫酸性脂肪酶產生菌具有重要意義。本試驗從鄭州市西郊富含油酯的土壤中分離篩選目標菌株，并對其酶學特性進行初步研究，為后續菌種改良及該菌產耐高溫酸性脂肪酶的應用奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 土樣采集

在鄭州西郊的榨油廠、飼料廠、汽車修理廠、花生地、菜市場、餐廳下水道等富含油污的土壤中，共采集50余個樣本，標記后備用。

1.1.2 主要試劑和儀器

主要試劑:橄欖油(西班牙產)、聚乙烯醇、三丁酸甘油酯、溴甲酚紫、吐溫－80:國產分析純。

主要儀器:HZQ－F160全溫振蕩培養箱:哈爾濱東聯電子有限公司;PYX－DHS隔水式電熱恒溫培養箱:上海躍進醫療器械廠;H1650－W臺式高速離心機:長沙湘儀儀器有限公司;YS 100攝像顯微鏡:日本Nikon;BSll0S電子天平:北京賽多利斯有限公司;JSM－6390LV型掃描電子顯微鏡:日本電子株式會社;TP600 PCR擴增儀:日本 TaKaRa BIO INC.;Mupid核酸電泳儀:泰國 ADVANCE－BIO Co.，Ltd;3730XL DNA測序儀:美國 Applied Biosystem公司等。

1.1.3 培養基

富集培養基(g/L):酵母膏 5.0，KH2PO41.5，Na2HPO42.0，NaCl 0.5，MgSO4·7H2O 1.0，橄欖油10.0 mL/L，pH 6.0。

溴甲酚紫平板初篩培養基(g/L):蛋白胨10.0，牛肉膏 5.0，NaCl 5.0，K2HPO41.0，瓊脂 15.0，PVA－ 橄欖油乳化液120 mL/L，Tween －80 4.0 mL/L，pH 6.0。培養基冷卻到60℃時，按0.4%加入過濾除菌后的溴甲酚紫指示劑(50 mg/100 mL，pH 6.5)，無菌條件下乳化倒平板。

種子培養基(g/L):蛋白胨 5.0，MgSO4·7H2O1.0，K2HPO41.0，(NH4)2SO45.0，葡萄糖 10.0，橄欖油 10.0 mL/L，pH 6.0。

發酵培養基(g/L):蛋白胨 5.0，酵母膏 20.0，蔗糖20.0，MgSO4·7H2O 1.0，(NH4)2SO42.0，K2HPO41.0，橄欖油 10.0 m/L，pH 6.0。

三丁酸甘油酯培養基:PVA－三丁酸甘油酯乳化液20.0 mL，LB 培養基18.0 mL，pH 5.5 乙酸 －乙酸鈉緩沖液 1 000 mL，瓊脂 18.0 g。

1.2 方法

1.2.1 產脂肪酶菌株的篩選

富集培養:稱取2 g土樣溶于20 mL無菌水中，振蕩搖勻制成土壤懸液，靜置，取每種土壤懸液3 mL加入到盛有50 mL富集培養基的三角瓶中，置于45℃、160 r/min搖床振蕩培養48 h后，無菌操作移取1 mL培養液至另一盛有新鮮富集培養基的三角瓶中繼續培養，相同條件下重復富集培養3輪［7］。

初篩培養:吸取1.0 mL富集培養液于9.0 mL無菌水中，將菌液進行梯度稀釋至1×10－5～1×10－7倍，分別取 50 μL涂布于平板初篩培養基，40℃倒置培養48～72 h，觀察有無黃色透明水解圈，通常菌落水解圈直徑與菌落直徑之比值(D/d)越大，該菌株產酶能力越強。將水解圈大的單菌落挑至斜面培養基上進行劃線培養，然后4℃保藏，以供復篩備用［8］。

復篩培養:將初篩挑選的菌株進行劃線分純。挑取一環分純后的菌落轉接到種子培養基中，40℃、160 r/min搖床振蕩培養24 h后按1%的接種量轉接到發酵培養基中，40℃、160 r/min搖床振蕩培養48 h［9］。

1.2.2 粗酶液的制備

Klebsiella sp.B－36經富集培養48 h后，取少量發酵液，12 000 r/min，4℃離心20 min，收集上清液即為粗酶液［10］。

1.2.3 酶活測定

采用橄欖油－聚乙烯醇乳化液滴定法，參照國標 GB/T 23535—2009［11］。

1.2.4 酶活定義

1 mL液體酶，在40℃和pH 7.5條件下，反應15 min，每分鐘水解底物產生1 μmol可滴定的脂肪酸，即為1個酶活力單位(U)，以U/mL表示。

1.2.5 酸性脂肪酶菌株的篩選

采用三丁酸甘油酯瓊脂平板鑒定法，操作步驟參考王琰等［12］。

1.2.6 菌株鑒定

形態觀察:根據《伯杰細菌鑒定手冊》［13］以及《常見細菌系統鑒定手冊》［14］，對篩選的菌株進行菌落形態和生理生化鑒定。

分子鑒定:測定特異性基因(16S rDNA)序列，將測序結果在NCBI上檢索比對。試驗方法如下:①變性:挑取B－36菌體于50 μL TaKaRa Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR(Code No.D304)中變性后離心取上清作為模板，反應條件為80℃，15 min。②PCR擴增:使用TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit(Code No.D310)進行PCR擴增目的片段，反應體系為前述①的變性反應液1 μL，PCR Premix 25 μL，Forward primer(20 pmol/μL)0.5 μL，Reverse primer2(20 pmol/μL)0.5 μL，16S － free H2O 23 μL;反應程序:預變性94 ℃，5 min，1 cycle;94 ℃變性 1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，30 cycles;72℃延伸5 min，1 cycle;取5 μL擴增產物進行3%瓊脂糖凝膠電泳，使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0(Code No.D823A)，切膠回收目的片段。③測序:以Seq Forward、Seq Internal和Seq Reverse為引物進行DNA測序。

1.2.7 酶學特性研究

酶反應最適溫度及熱穩定性:將酶液分別在35～75℃條件下測酶活，確定該酶的最適反應溫度，然后將酶液分別置于不同溫度(40～80℃)的恒溫水浴鍋中保溫70 min，每隔10 min取樣測定殘余酶活［15］。

酶反應的最適pH值和pH穩定性:用磷酸鹽緩沖液作為緩沖體系進行脂肪酶水解活力的測定，在不同pH(2.0～8.0)條件下測酶活，確定該酶的最適pH值，然后將酶液與不同pH值(2.0～6.0)緩沖液以1∶3的比例混合，40℃靜置1 h后測酶活［16］。

金屬離子對酶活力的影響:分別將酶液與10 mmol/L 的 Ca2+、K+、Fe3+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、EDTA、Na+和Mg2+等體積混合，室溫下靜置1 h后測酶活，以未添加任何金屬離子的反應體系作為對照［7］。

2 結果與分析

2.1 產脂肪酶菌株的篩選

經過富集、初篩、復篩等過程，用溴甲酚紫平板從富含油脂的土壤中篩選得到產脂肪酶的菌株，其中大部分的酶活都在5.0～9.6 U/mL之間。對酶活力9.0～9.6 U/mL的菌株進行酸性三丁酸甘油酯平板篩選，得到8株能夠在pH 5.5的酸性平板上生長并且有透明的水解圈，將以上篩選到的8株菌按1%的接種量轉接于發酵培養基中，40℃、160 r/min培養48 h后測酶活，其中B－36菌株酶活力最高，為9.2 U/mL。雖然其初步發酵酶活力同已知相關菌種伯克氏菌(Burkholderia pseudomallei)(酶活力達50.50 U/mL)［17］及地霉屬(Galactomyces geotrichum)真菌 FL002(酶活力達 75.50 U/mL)［12］有一定差距，但考慮到菌種資源發掘的特殊性(事實上采用Klebsiella sp.發酵產耐高溫酸性脂肪酶在國內外未見報道)，本試驗選擇B－36菌株作為出發菌株，對其進行酶學特性研究。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 形態學及生理生化鑒定

將篩選到的B－36菌株涂布于溴甲酚紫平板初篩培養基上進行形態觀察，發現其菌落呈黃色或橙色，表面光滑凸起，革蘭氏染色陰性，掃描電鏡(SEM)觀察(圖1)，菌體大小為0.5 ～0.8 ×1 ～3 μm之間，單獨、成雙或短鏈狀排列，無芽孢，無鞭毛。常規生理生化測試表明，菌株B－36甲基紅試驗陰性，V.P.試驗陰性，接觸酶陽性，氧化酶陰性，發酵葡萄糖、麥芽糖，乳糖、木糖、蔗糖、D－山梨醇，不發酵D－阿拉伯糖、D－甘露醇，水解淀粉，石蕊牛奶試驗陰性，檸檬酸鹽試驗陰性，硫化氫試驗陰性，硝酸鹽還原試驗陽性，亞硝酸還原陰性，不液化明膠，產脂酶，不產脲酶，不產吲哚。

圖1 菌株B－36的形態觀察(SEM)(放大12 000倍)

2.2.2 分子生物學鑒定

菌株B－36 16S rRNA基因含有高度保守的基因片段，大約1.5 Kb，其PCR擴增產物3%瓊脂糖凝膠電泳見圖2，在1 000～2 000 bp之間有明顯的條帶，這表明PCR反應擴增出了預期長度的16S rDNA序列，送到大連寶生物工程有限公司進行測序，將測得的序列提交GenBank數據庫中進行BLAST比對(登錄號:JQ793784)，用 MEGA 4.1構建系統進化樹。構建結果如圖3。與菌株B－36序列相似度高的相關菌株均為克雷伯氏菌屬，系統發育分析得出該菌與 HM352367.1(Klebsiella sp.)在同一個分支上，親緣關系最近，相似性達99%以上，再結合形態和生理生化特征，可以初步鑒定該菌為克雷伯氏菌，命名為 Klebsiella sp.B －36。

圖2 16S rDNA基因PCR反應產物凝膠電泳結果

由寶生物工程(大連)有限公司測得的B－36菌株16S rDNA序列如下:ACGCTGGCGGCAGGCCTAA CACATGCAAGTCGAGCGGTAGCACAGAGAGCTTGCT CTCGGGTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTCT GGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAA ACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAA GTGGGGGACCTTCGGGCCTCATGCCATCAGATGTGCC CAGATGGGATTAGCTGGTAGGTGGGGTAACGGCTCAC CTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACC AGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTA CGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCG CAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAG GCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGGGGAGGAAG GCGGTGAGGTTAATAACCTTGTCGATTGACGTTACCC GCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCC GCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATT ACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGT CGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCA TTCGAAACTGGCAGGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGG TA GAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGAT CTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGA CAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGC AAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAA CGATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGC TTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAG TACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGG CCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGA TGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCAC AGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACT GTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGT TGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAAC CCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCCGGGAACTC AAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGG GGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGG CTACACACGTGCTACAATGGCATATACAAAGAGAAG CGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTATG TCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATG AAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTA CGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCG TCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTA GCTTAACTCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATT CATGACTGGG(1455 bp)

圖3 菌株B－36系統進化樹

2.3 菌株B－36酶學特性

2.3.1 酶反應最適溫度和熱穩定性

在35～75℃，間隔5℃的不同溫度下測酶活，結果如圖4a可知，該酶的適宜反應溫度為60℃，但是在75℃時，該酶依然存在50%的活性，屬于高溫脂肪酶。此外，將酶液置于40～80℃，間隔10℃的不同溫度的恒溫水浴鍋中保溫70 min，每隔10 min取樣，在60℃下測酶活，用未經處理的酶液作對照。結果見圖4b，該酶在60℃之內穩定性較好，處理70 min中酶活力還保持在80%以上，當溫度超過60℃時，酶活力逐漸降低，但70、80℃處理30 min后對酶活力無顯著影響，均保持在80%以上。70℃處理70 min后還有70%的酶活力;80℃處理70 min后還有46%的酶活力，說明該酶具有良好的熱穩定性。目前，國外已報道熱穩定性較好的耐熱脂肪酶——環狀芽孢桿菌(Bacillus circulansⅢB153)脂肪酶，該酶在40～60℃之間具有良好的熱穩定性，在60℃處理1 h后還有80%以上的酶活力;80℃處理1 h后還有45%的酶活力［18］。國內已報道根霉SFE－L01脂肪酶，該酶在30～60℃之間具有良好的熱穩定性，在70℃處理70 min后還有62%的酶活力，80℃處理70 min后還有35%的酶活力［19］。

圖4 B－36產脂肪酶作用的最適溫度及酶的熱穩定性

2.3.2 酶反應的最適pH值和pH穩定性

配制pH 2.0～8.0、間隔1個 pH值單位的緩沖液，測相同酶液在不同pH值條件下的酶活力，結果如圖5a，該酶作用的適宜pH 4.0，可見該酶是一種酸性脂肪酶。對該酶進行耐酸性試驗，將酶液與不同pH 值(2.0 ～6.0)緩沖液以1∶3 的比例混合，40 ℃靜置1 h，再將酶液調回到最適pH值測酶活，用未經處理的酶液作對照。結果如圖5b，該酶在酸性環境中保溫1 h后可保持70%以的酶活力，尤其在pH 4.0時可保持83.2%的酶活力，因此，說明該酶在酸性條件下較為穩定。目前，國外已報道pH穩定性較好的耐酸性脂肪酶——嗜熱青霉(Mesophilic Penicillium)脂肪酶，該酶在pH 4.0～6.0之間比較穩定，在pH 5.0時作用2 h后，仍能保持65%以上的酶活;80℃處理1 h后還有45%的酶活力［3］。國內已報道地霉屬Galactomyces geotrichum FL002菌株產脂肪酶在pH 6.0～8.5 之間比較穩定，在pH 6.0 時作用1 h后，仍能保持80%的酶活力［12］。

圖5 脂肪酶作用的最適pH及酶的pH穩定性

2.3.3 金屬離子及EDTA對脂肪酶穩定性的影響

分別將酶液與 10 mmol/L的 Ca2+、K+、Fe3+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、Na+、Mg2+和 EDTA 等體積混合，室溫下靜置1 h后測酶活，以未添加任何金屬離子的反應體系作為對照，結果如圖6。Mg2+對脂肪酶的水解具有強烈的激活作用，使酶活力提高了2倍多;Ca2+、Mn2+、EDTA以及 Na+對酶有明顯的激活作用，Fe3+、Cu2+及Zn2+對酶水解有較強的抑制作用，K+對酶幾乎沒有作用，初步判定該酶是金屬離子依賴酶。

圖6 金屬離子及EDTA對酶穩定性的影響

3 結論

本試驗從50余個土壤樣品中分離篩選到8株產酸性脂肪酶的菌株，對其中一株高產菌株B－36通過形態觀察、生理生化特征以及16S rDNA序列分析，鑒定為克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)。對該菌株脂肪酶性質研究結果可知:其適宜作用溫度為60℃，適宜作用pH 4.0，并且在60℃處理70 min中酶活力還保持在80%以上，說明該酶具有良好的熱穩定性;同時該酶在酸性環境中保溫1 h后可保持70%以上的酶活力，尤其在 pH 4.0時仍保持83.2%的酶活力，說明該酶在酸性條件下較為穩定。與其他種類的脂肪酶相比，Klebsiella sp.B－36所產脂肪酶兼具耐熱和耐酸特性，具有較大的開發應用潛力，可以作為微生物脂肪酶生產的出發菌株，為菌種改良或構建高效脂肪酶基因工程菌奠定了基礎。

［1］Contesini F J，Lopes D B，Macedo G A，et al.Aspergillus sp.lipase:potential biocatalyst for industrial use［J］.Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic，2010，67(3):163 －171

［2］Guncheva M，Zhiryakova D.Catalytic properties and potential applications of Bacillus lipase［J］.Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic，2011，68(1):1 －21

［3］Gutarra M L，Godoy M G，Maugeri F，et al.Production of an acidic and thermostable lipase of the mesophilic fungus Penicillium simplicissimum by solid － state fermentation［J］.Bioresource Technology，2009，100(21):5249 －5254

［4］Fickers P，Marty A，Nicaud J M，et al.The lipases from Yarrowia lipolytica:genetics，production，regulation，biochemical characterization and biotechnological applications［J］.Biotechnology Advances，2011，29(6):632 － 644

［5］Lafuente R F.Lipase from Thermomyces lanuginosus:uses and prospects as an industrial biocatalyst［J］.Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic.2010，62(4):197 －212

［6］Rafael C，Roberto F L.Lipase from Rhizomucor miehei as an industrial biocatalyst in chemical process［J］.Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic，2010，64(1):1 －22

［7］Arifin A R，Kim S J，Yim J H，et al.Isolation and biochemical characterization of Bacillus pumilus lipases from the antarctic［J］.Journal of Microbiology and Biotechnology，2013，23(5):661－667

［8］Park D H，Yoo H Y，Ryu H W，et al.Isolation and screening lipase－producing soil bacteria and its application to biodiesel production［J］.Journal of Biotechnology，2010，150:175 －180

［9］Mehta A，Kumar R，Gupta R，et al.Isolation of lipase producing thermophilic bacteria:optimization of production and reaction conditions for lipase from Geobacillus sp.［J］.Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica，2012，59(4):435 －450

［10］Velu N，Divakar K，Nandhinidevi G，et al.Lipase from Aeromonas caviae AU04:isolation，purification and protein aggregation［J］.Biocatalysis and Agricultural Biotechnology，2012，1(1):45 －50

［11］GB/T 23535—2009，Lipase preparations［S］

［12］王琰，張志敏，王斌，等.耐酸性脂肪酶產生菌的篩選及酶學性質研究［J］.飼料工業，2011，32(10):29 －33

［13］Buchanan R E，Gibbons N E.Bergey's manual of determinative bacteriology［M］.8th ed.Balt7imore:The Williams and Wilkins Company，1974

［14］東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統鑒定手冊［M］.北京:科學出版社，2001

［15］Selvin J，Kennedy J，Lejon D P，et al.Isolation identification and biochemical characterization of a novel halo－tolerant lipase from the metagenome of the marine sponge Haliclona simulans［J］.Microbial Cell Factories，2012(11):1475 －1486

［16］Tanaka D，Yoneda S，Yamashiro Y，et al.Characterization of a new cold－adapted lipase from Pseudomonas sp.TK －3［J］.Applied Biochemistry and Biotechnology，2012，168(2):327－338

［17］閆麗娟，謝振榮，趙春雷，等.耐高溫酸性脂肪酶菌株NJY－1－3的選育及發酵條件的研究［J］.食品科技，2010，35(3):11 －15

［18］Johri S，Bhat A，Sayed S，et al.Novel thermostable lipase from Bacillus circulansⅢB153:comparison with the mesostable homologue at sequence and structure level［J］.World of Journal Microbiology and Biotechnology，2012，28(1):193－203

［19］孫春艷，趙祥穎，董學前，等.1株產耐熱脂肪酶根霉突變株的選育［J］.食品與發酵工業，2012，38(3):109 －114.