葛根芩連湯及不同配伍對肝細胞色素P450酶的影響

陳 燁， 袁 瑾， 王新宏， 安 叡， 肖 娟， 張宜凡

(上海中醫藥大學，上海201203)

細胞色素P450(CYP450)酶系是參與各種體內藥物代謝的重要組成部分。該酶可被藥物等外源物誘導或抑制，導致其水平和活性的改變，從而直接影響藥物在體內的血藥濃度、動力學變化以及后續生物學效應。CYP450酶檢測主要有體內和體外兩種方法［1］，Cocktail探針藥物法是最常用的體內檢測法。它可以同時評價幾種藥物代謝酶的活性，即給予多種相對低劑量的探針藥物，通過檢測生物樣本中每種探針藥物的血漿動力學從而獲取多個代謝酶的活性信息［2-4］。利用Cocktail探針藥物法測定催化特定底物的CYP450酶活性，可用于分析比較藥物不同配伍關系中酶活性的差異［5］。

葛根芩連湯出自張仲景的《傷寒論》，由葛根、黃芩、黃連及炙甘草四味中藥組成［6］，方中葛根為君藥，黃芩、黃連 (芩連)為臣藥，炙甘草為佐使藥。組方精簡，配伍嚴謹。現代臨床應用廣泛，常用于急、慢性腸炎、細菌性痢疾、II型糖尿病、小兒腹瀉等陽明里熱證［7-8］。本實驗采用Cocktail探針藥物法，選擇咖啡因［9］、甲苯磺丁脲［10］、右美沙芬［11］、氯唑沙宗［12］和咪達唑侖［9］分別作為 CYP1A2、CYP2C6、CYP2D4、CYP2E1和CYP3A1/2 5種不同亞型酶的探針底物，研究葛根芩連湯全方及其不同配伍對5種亞型酶活性的作用，探尋其不同配伍對CYP450酶活性的影響，希冀為深入研究葛根芩連湯組方原理、配伍合理性和科學性奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器 SHIMADZU高效液相色譜儀，包括自動進樣器、真空脫氣機 (日本島津公司);三重四級桿質譜儀，包括 ESI離子源和 Analyst version 1.4.2色譜工作站 (API 3000，AB，U．S．A);氮吹儀 (上海安譜科學儀器);Eppendorf Cen ANPEL DC-1trifuge 5415R小型高速冷凍離心機 (艾本德中國有限公司);AL104電子天平 (瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司);QT—1漩渦混合器 (上海琪特分析儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑 對照品:甲苯磺丁脲 (tolbutamide)(批號100500-201001)、右美沙芬 (dextromethorphan) (批號100201-201003)、氯唑沙宗(chlorzoxazone)(批號100364-201001)、卡馬西平(carbamazepine)(批號100142-201004)、氯霉素(chloramphenicol)(批號130555-201002)均購自中國食品藥品檢定研究院;咖啡因 (caffeine)(批號201004)、咪達唑侖 (midazolam) (批號201001)均購自上海瑞齊生物科技有限公司。

試劑:乙腈、甲醇和甲酸均為HPLC級 (美國Merck公司)，乙酸乙酯、無水乙醇和乙酸銨 (AR級)購于國藥集團化學試劑有限公司;雙蒸水，實驗室自制。

1.3 藥材 葛根飲片Puerariae lobatae Radix，四川 (批號20100525);黃芩飲片Scutellariae Radix，河北 (批號20100805);黃連飲片Coptidis Rhizoma，四川 (批號20100720)，以上飲片均購于上海康橋中藥飲片有限公司。炙甘草飲片Glycyrrhizae Radix et Rhizoma preparatum cum melle，新疆 (批號20100705)，購于上海金橋養和堂藥店。上述飲片經陳燕軍主管藥師鑒定，符合2010版《中國藥典》一部規定。

1.4 動物 清潔級SD大鼠，體質量 (200±20)g，雄性，合格證號:SCXK(2008-0016)，由上海中醫藥大學實驗動物中心提供。

2 實驗方法

2.1 Cocktail探針藥物溶液的制備 取探針藥物咖啡因、甲苯磺丁脲、右美沙芬、氯唑沙宗及咪達唑倫適量，精密稱定至同一容量瓶中，以0.9%氯化鈉注射液定容至刻度，配置成質量濃度分別為0.209、0.104、0.205、0.103、0.109 mg/mL的混合探針藥物溶液，溶液于給藥前新鮮配制，用于大鼠尾靜脈注射。

2.2 藥液制備 按處方配比取葛根芩連湯(葛根∶黃芩∶黃連∶甘草為5∶3∶3∶2)各味藥材飲片，加8倍量水，葛根先煎20 min［13］，余藥共煎30 min，煎煮兩次，濾過，合并濾液，濃縮，制成每毫升含1 g生藥的藥液。葛根組、芩連組(黃芩和黃連)、甘草組樣品制備方法同上，最終定容到相同體積。

2.3 標準曲線及質控樣品制備 精密配制并稀釋咖啡因質量濃度至 11.6、29、58、290、580、1 160、2 320 ng/mL;精密配制甲苯磺丁脲1 020 ng/mL、右美沙芬216ng/mL、氯唑沙宗1 030 ng/mL、咪達唑侖120 ng/mL，分別同上稀釋至不同質量濃度。取內標對照品適量，精密稱定后用甲醇溶液定容至1 mg/mL溶液，并稀釋制得1 μg/mL卡馬西平和氯霉素內標液。向空白血漿中加入一定量各待測物的對照品和內標，即得標準曲線樣品。

質控樣品 (n=5)配制方法參照標準曲線樣品制得低、中、高三個質量濃度樣品，質量濃度分別為 11.6、290、2 320 ng/mL(咖啡因);5.1、127.5、1 020 ng/mL(甲苯磺丁脲);1.1、27、216 ng/mL (右 美 沙 芬 );5.2、128.8、1 030 ng/mL(氯唑沙宗);0.6、15、120 ng/mL(咪達唑侖)。

2.4 分組及給藥 30只雄性SD大鼠隨機分為5組，每組6只，分別為全方組、葛根組、芩連組、甘草組、空白對照組。每日早晨空腹灌胃，給予相應組別的湯劑15 mL/kg，空白對照組給予相同體積的生理鹽水。連續給藥7 d，均于實驗前禁食12 h后，尾靜脈注射Cocktail混合探針藥物溶液，給藥量5 mL/kg，注射劑量為咖啡因1.0 mg/kg，甲苯磺丁脲0.5 mg/kg，右美沙芬1.0 mg/kg，氯唑沙宗0.5 mg/kg，咪達唑侖 0.5 mg/kg，給藥后0.083 3、0.25、0.5、1、1.5、2、4、8、12、24 h眼眶取血，8 000 r/min離心5 min，分離血漿。

2.5 樣品處理 100μL血漿中加入1μg/mL卡馬西平和氯霉素內標溶液各10μL，渦旋混合1 min，加入1 mL乙酸乙酯，渦旋3 min，12 000 r/min離心5 min(4℃)，移取上清液，N2吹干，殘留物加入流動相100μL振蕩重組，12 000 r/min離心5 min(4℃)，取上清液進樣。

2.6 LC-MS/MS測定條件

2.6.1 色譜條件 Inertsil ODS-SP色譜柱 (2.1 mm×100 mm，5μm);流動相為水 (含5 mmol/L乙酸銨，A)-乙腈 (含0.1%甲酸，B)梯度洗脫(0～1.5 min，B:55%;1.5 min～2 min，B:55% ～95%;2 min～3 min，B:95%;3 min～3.5 min，B:95% ～55%;3.5 min～5 min，B:55%);體積流量0.3 mL/min;柱溫為室溫;進樣量10μL。

2.6.2 質譜條件 采用正負離子模式檢測，多反應監測模式 (MRM)測定。正離子模式內標為卡馬西平，負離子模式內標為氯霉素。主要質譜參數為:氣簾氣 (CUR)流量8 L/min;霧化氣(NEB)流量8 L/min;碰撞氣 (CAD)流量12 L/min;離子噴霧電壓 (IS)2 000 V;離子源溫度(TEM)350℃;其它特征參數如下表1。

表1 混合探針藥物及內標質譜參數Tab.1 Mass spectrum parameters of the probe drugs and two internal standards

3 方法學考察

3.1 系統專屬性試驗 取大鼠空白血漿100μL，按照2.5項操作，得到空白血漿色譜圖;同樣操作得到混合探針藥物溶液血漿色譜圖和大鼠尾靜脈給藥后1 h血漿色譜圖。結果表明，在測定條件下，樣品測定無干擾，方法專屬性高。

3.2 線性范圍考察 以待測物質量濃度為橫坐標，待測物與內標物的峰面積比值為縱坐標，用加權最小二乘法進行線性回歸，計算標準曲線回歸方程，結果表明各組分線性關系良好。結果見表2。

表2 線性關系結果Tab.2 Calibration curve，linear range and correlation coefficient

3.3 精密度和準確度試驗 取空白血漿100μL，配制低、中、高3個質量濃度的質控 (QC)樣品，每一質量濃度進行五個樣本分析，連續測定3 d，以隨行標準曲線，計算QC樣品中各成分的實測質量濃度，根據QC樣品的各成分實測質量濃度計算本法的日內和日間精密度、準確度。結果表明，本方法的高、中質量濃度的樣品精密度RSD＜15%，準確度RE＜15%;低質量濃度樣品RSD＜20%，準確度RE＜20%，符合《化學藥物臨床藥代動力學研究技術指導原則》相關要求。

3.4 基質效應 取低、中、高三個質量濃度的QC樣品，每一質量濃度進行五個樣本分析。同時，另取空白血漿100μL，除不加標準溶液外，其它按2.5項下的方法操作，所得的殘留物加入相應質量濃度的混合標準溶液10μL，內標10μL，渦旋混合，進樣分析，獲得相應的峰面積。結果表明，本方法低中高3個質量濃度樣品的RSD＜15%，樣品不受基質干擾。

3.5 提取回收率試驗 空白血漿中加入低、中、高3個質量濃度的QC樣品，按2.5項下的方法操作，測得血漿中待測成分和內標的峰面積;其與甲醇配制的低、中、高3個質量濃度的QC樣品的峰面積相比，即各成分的提取回收率。各成分在血漿樣品中的提取回收率分別為咖啡因75.7%～111.1%(RSD為5.7% ～10.1%)、甲苯磺丁脲75.9% ～94.1%(RSD為4.2% ～10.4%)、右美沙芬105.3% ～114.4%(RSD為7.4% ～12.1%)、氯唑沙宗98.8%～109.5% (RSD為8.1%～9.9%)、咪達唑侖 88.6% ～103.8% (RSD為6.5% ～10.3%)。

3.6 穩定性考察試驗 取低、中、高3個質量濃度的QC樣品，在室溫下 (24℃)放置4 h，4℃保存24 h，在－70℃冰箱內保存一個月，反復凍融 (三個冷凍－解凍循環)，按2.5項下的方法處理，再進行測定 (n=5)，結果表明各成分在上述條件下的穩定性符合規定。

4 實驗結果

4.1 藥時曲線 大鼠靜脈注射Cocktail探針藥物后所測得的各組分血藥濃度－時間數據用DAS軟件擬合，房室模型分析結果數據符合單房室模型，血藥濃度－時間曲線見圖1。

圖1 各組分血藥濃度藥時曲線Fig.1 Plasma concentration-time profiles of different compatibilities

4.2 藥代動力學參數 比較組方與空白組探針藥物藥代動力學參數AUC值可推斷其對代謝酶活性的影響。若組方AUC值較空白組減小，說明組方能誘導代謝酶活性，其生物轉化率增加，血藥濃度降低;反之，若組方AUC值較空白組增大，則組方抑制代謝酶活性。從表3所得結果可以初步推測，葛根芩連湯全方能誘導大鼠 CYP2C6、CYP2D4的活性，抑制 CYP2E1的活性，對CYP1A2、CYP3A1/2無影響。葛根單方能誘導CYP2C6、CYP3A1/2活性，抑制大鼠 CYP2D4及CYP2E1活性，對CYP1A2無影響。芩連能誘導CYP2C6 的 活 性， 抑 制 CYP1A2、CYP2D4、CYP2E1的活性、對CYP3A1/2無影響。甘草能誘導CYP1A2、CYP2C6和 CYP2D4的活性，抑制CYP3A1/2的活性，對CYP2E1無影響。

表3 5種探針藥物藥代動力學參數 (±s，n=6)Tab.3 Pharmacokinetic parameters of five probe drugs(±s，n=6)

表3 5種探針藥物藥代動力學參數 (±s，n=6)Tab.3 Pharmacokinetic parameters of five probe drugs(±s，n=6)

注:與空白組比較，*P＜0.05

底物/亞型酶 分組 t1/2/h AUC0－t/(μg·h·L－1) CL/(L·h－1·kg－1) MRT0－t /h咖啡因/CYP1A2 空白組 0.799±0.063 1 639.099±189．065 0.582±0.069 1.042±0.063*全方組 0.791±0.031 1 654.326±223．726 0.58±0.079 1.11±0.048葛根組 0.825±0.053 1 514.257±244．348 0.582±0.069 1.152±0.092芩連組 0.654±0.096* 2 071.949±228．581* 0.627±0.108 0.959±0.074甘草組 0.797±0.101 793.357±94．732* 1.159±0.189* 0.934±0.069甲苯磺丁脲/CYP2C6 空白組 8.128±0.460 10 315.411±153．207 0.422±0.003 6.082±0.719全方組 6.925±0.817 7 265.902±774．279* 0.057±0.005 7.843±0.709葛根組 6.561±0.499 7 985.303±1 285．381* 0.053±0.003 8.012±0.414*芩連組 4.425±0.452 6 693.134±359．103* 0.070±0.004 7.052±0.374*甘草組 4.590±0.191 5 635.793±163．038* 0.085±0.003 8.054±0.309*右美沙芬/CYP2D4 空白組 1.531±0.245 289.044±14．789 2.136±0.261 1.722±0.126全方組 0.390±0.026 121.341±23．786* 7.444±1.283 1.657±0.065葛根組 1.180±0.121* 337.647±40．135* 2.824±0.324 1.905±0.194*芩連組 0.923±0.172* 333.314±23．531* 2.841±0.229 1.470±0.136*甘草組 0.904±0.156 244.924±29．419* 3.848±0.425 1.609±0.061氯唑沙宗/CYP2E1 空白組 0.383±0.031 588.457±40．033 0.620±0.060 0.843±0.081全方組 0.325±0.022 700.591±111．469* 0.666±0.107 0.812±0.099葛根組 0.308±0.017* 738.575±102．343* 0.722±0.097 0.789±0.054芩連組 0.404±0.038 730.200±63．779* 0.619±0.099 0.829±0.116甘草組 0.345±0.048 614.598±80．612 0.713±0.125 0.973±0.053*咪達唑侖/CYP3A1/2 空白組 0.506±0.040 70.227±12．849 6.569±1.133 0.839±0.058全方組 0.374±0.055 70.246±9．063 6.440±0.838 0.849±0.070葛根組 0.443±0.046 47.875±4．387* 8.654±0.598 0.956±0.106*芩連組 0.453±0.013 75.500±14．774 5.506±0.323 0.776±0.071甘草組 0.256±0.029* 83.504±14．203* 8.551±1.208* 0.472±0.037*

5 討論

目前檢測肝藥物代謝酶主要有體內和體外兩種方法。體外代謝法包括體外肝微粒體溫孵法、肝灌流法及肝組織切片法等。它是在體外模擬生理環境下進行代謝反應并對原形藥及代謝產物進行分析的方法，該方法較為簡單，但有時不能全面反映體內的綜合代謝情況，與生物體內的真實代謝情況存在一定差異［14］。體內代謝法是指服藥后經過一段時間收集生物樣品，然后分析樣品中藥物及藥物代謝產物的方法。Cocktail探針藥物法是體內代謝的主要方法，其實驗結果更符合真實代謝情況;可以同時檢測多種藥物代謝酶的活性;降低個體間和個體內藥物代謝酶活性變異的影響。課題組前期采用體外肝微粒體溫孵法，初步研究了葛根芩連湯全方及其不同配伍組對體外肝微粒體亞型酶活性的影響，結果提示不同配伍組對CYP450酶具有一定的誘導或抑制效應。

本實驗在前期工作基礎上采用體內Cocktail探針藥物法，深入研究葛根芩連湯全方及方中葛根組、芩連組及甘草組對5種CYP450亞型酶活性的影響。采用LC-MS/MS法檢測不同時間點的全血中各探針藥物的濃度，用DAS2.0軟件計算其藥代動力學參數，用統計軟件SPSS19.0分析空白組與實驗組各種探針AUC值的差別，評價各組藥物對CYP450亞型酶誘導或抑制的影響，方法較為可靠。

研究結果表明葛根芩連湯全方、葛根組、芩連組均對CYP2E1產生顯著的抑制作用，且葛根組的抑制作用較強，推測全方對CYP2E1的抑制作用主要來自君藥葛根。該方可減緩該亞型酶對藥物的代謝速率，一定程度上有助于體內吸收。大鼠CYP2E1和人CYP2E1有很好的相關性［15］，此結果可為臨床用藥提供參考。全方對CYP1A2無顯著影響，推測可能由于甘草組誘導CYP1A2的活性而芩連組抑制其活性所致;同樣，全方對CYP3A1/2無顯著影響可能是葛根組的誘導作用和甘草組的抑制作用所致。

復方配伍中不同中藥構成了復雜的相互作用體系，這些相互作用是復方整體效應的重要基礎，藥物代謝酶是影響藥物體內相互作用的主要因素。通過文獻［16-19］可知CYP450代謝酶不僅在藥物的代謝、降解和排泄中起著重要作用，并且對復方配伍研究具有重要意義。本研究從“藥物配伍-代謝”關系探討復方配伍機制，為深入認識葛根芩連湯配伍機制提供事實依據，有利于更科學、更合理地指導臨床用藥。

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