維藥羅勒提取物對小鼠巨噬細胞RAW264.7生長及其胞內5-脂氧酶活性的影響

米娜瓦爾·哈帕爾， 阿孜古麗·吐爾遜， 周文婷， 程路峰， 依巴代提·吐乎提，娜迪熱·熱依木， 艾尼瓦爾·吾買爾*

(1.新疆醫科大學基礎醫學院藥理教研室，新疆烏魯木齊830011;2.新疆醫科大學第一附屬醫院細胞生物學室，新疆烏魯木齊830011;3.新疆醫科大學第二附屬醫院內科，新疆烏魯木齊830063)

羅勒Ocimum basilicum L．是維吾爾醫應用歷史悠久的常用藥材之一，是唇形科植物羅勒的地上部分，一年生草本，全國各地均有栽培。羅勒具有疏風解表、化濕和中、行氣活血、強心安神、解毒消腫等功效［1-2］，主治感冒頭疼、發熱咳嗽、中暑等。其主含的化學成分有揮發油類、黃酮及其苷類、香豆素類，此外還含有三萜類和生物堿類等成分［3-4］。本課題組前期發現羅勒乙酸乙酯提取物對環氧合酶途徑具有抑制作用［5-8］，本研究旨在檢測羅勒提取物對經脂多糖刺激的RAW264.7細胞生長以及胞內5-酯氧酶活性的影響，探討羅勒提取物對體內花生四烯酸代謝網絡的另一通路——5-酯氧酶途徑的可能影響。

1 材料與方法

1.1 儀器 倒置熒光顯微鏡 (OLYMPUS，日本);高速多功能冷凍離心機 (BR4i型，法國);生物安全柜 (Haier，中國);CO2培養箱 (Thermo，美國);全波長酶標儀 (Benchmark PLUS，德國)。

1.2 試劑與材料 小鼠腹腔巨噬細胞(RAW264.7)購于中科院上海細胞庫 (中國典型培養物保藏中心CCTCC);羅勒:2010年9月采自新疆吐魯番市托克遜縣種植基地，品種由新疆醫科大學藥學院天藥/生藥學教研室帕麗達·阿不力孜教授鑒定;DMEM干粉培養基 (GIBCO公司);胎牛血清 (FBS)(GIBCO公司);四唑藍 (MTT)(Sigma公司);吲哚美辛 (Sigma公司);脂多糖脂多糖 (Sigma公司);前列腺素 E2(PEG2)ELISA試劑盒 (GBD公司，批號:BA3248)，花生四烯酸 (Sigma公司);胰蛋白酶 (GIBCO公司);PBS緩沖液;白三烯B4ELISA試劑盒 (武漢中美科技有限公司，批號:BA2043);NDGA(Sigma公司)。

1.3 方法

1.3.1 羅勒的提取與分離 將陰干后的羅勒地上部分剪碎，稱取200 g，在室溫條件下用2 600 mL、75%乙醇密閉浸泡24 h后采用超聲儀進行提取，用旋轉蒸發儀減壓濃縮回收乙醇得到乙醇提取物，再用適量水分散提取物后，依次用乙酸乙酯，正丁醇萃取，萃取液揮干后得到羅勒提取物 (羅勒乙酸乙酯、羅勒正丁醇提取物)，冷凍干燥。實驗時用適量的二甲基亞砜DMSO溶解后，用DMEM培養基稀釋成所需的質量濃度，再以0.22μm濾器過濾，放置4℃冰箱保存備用。

1.3.2 細胞培養 復蘇后的RAW264.7細胞轉入細胞培養瓶中，加入含有10%胎牛血清、青霉素100μg/mL、鏈霉素100μg/mL的DMEM高糖培養基，37℃，5%CO2培養箱中培養，約3～5 d細胞鋪滿80%瓶底后，用0.25%胰蛋白酶消化約3～5 min后傳代。根據需要部分細胞繼續傳代培養，部分收集計數后凍存備用。

1.3.3 繪制RAW264.7細胞的生長曲線 取生長狀態良好的細胞，采用一般的傳代方法進行消化，制成細胞懸液。以1×105個/mL的密度將細胞接種于96孔板中，按MTT法［9］，于490 nm波長處測定OD值，每天1次，連續10 d。以培養時間為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制細胞生長曲線。

1.3.4 觀察羅勒提取物對正常RAW264.7細胞生長的影響 以適量的二甲基亞砜溶液DMSO溶解羅勒乙酸乙酯和羅勒正丁醇提取物以后，以含10%FBS和雙抗的DMEM培養基稀釋成所需藥物溶液 (400、200、100、50、25μg/mL)，稀釋后的藥物溶液中DMSO的終體積分數控制在0.5%以內 (預試驗發現12.5μg/mL的藥物溶液在任何一個時間段對細胞的生長均無明顯作用，而細胞加入600、800μg/mL的藥物溶液后，到48 h細胞就會脫落，導致死亡)，于4℃ 冰箱備用。按MTT法于490 nm波長處測定24、48、72、96 h時的OD值，求出IC50值，并計算細胞的存活率。

1.3.5 羅勒提取物對經脂多糖刺激的RAW264.7細胞生長的影響 采用細胞存活率為90%左右的藥物濃度，即羅勒乙酸乙酯提取物和羅勒正丁醇提取物最大給藥質量濃度為100μg/mL。再設五個梯度 (公比為2)，配置時以DMEM培養基稀釋，通過MTT法檢測羅勒提取物對不同時間脂多糖處理后的RAW264.7細胞生長的影響。實驗步驟:將指數生長期的RAW264.7細胞以1×105個/mL的密度接種于96孔培養板中，每孔200μL，設空白組，模型組 (以脂多糖刺激致炎)，陽性對照組(白三烯B4終濃度為100μmol/L)和給藥組 (不同質量濃度的羅勒提取物)，每組4個復孔，放置37℃，5%CO2培養箱中培養24 h。次日棄去舊培養基，除空白組外，其余每孔均加入脂多糖溶液200μL(1 mg/L)，于培養箱中孵育12 h后，棄去每孔上清液，空白組與模型組加入新鮮培養基，其它組分別加入配置好的各組藥物，每孔200μL，繼續培養12、24、48 h。依照MTT法，于490 nm波長處測定OD值，計算細胞的存活率。

1.3.6 羅勒提取物在體外對5-脂氧酶活性的影響

將指數生長期的RAW264.7細胞以1×105個/mL的密度接種于96孔培養板中，每孔200μL，設空白組，模型組 (以脂多糖刺激致炎)，陽性對照組(白三烯B4終濃度為100μmol/L)和給藥組 (不同質量濃度的羅勒提取物)，每組4個復孔，放置37℃，5%CO2培養箱中培養24 h。次日更換舊培養基，除空白組以外的其它孔均加入終質量濃度1 mg/L的脂多糖進行干預，繼續培養12 h后，給藥組分別加入配置好的不同質量濃度的羅勒提取物，空白組和模型組加入終體積分數為0.5%的DMSO，放置孵箱中繼續孵育。24 h后每個組加入終濃度為10μmol/L的底物花生四烯酸，37℃孵育30 min，收集細胞上清液，－20℃凍存待測。用ELISA法 (嚴格按照試劑盒說明進行操作)測定細胞上清液中白三烯B4的濃度，并計算抑制率。

抑制率 =［(模型組OD值 －給藥組OD值)/模型組OD值］×100%

2 結果

2.1 MTT法繪制RAW264.7細胞的生長曲線 經過觀察RAW264.7細胞10 d的基本生長規律，發現接種后的24 h內細胞的吸光度有一定的下降，再經過24 h的滯留期后，細胞將進入一個對數生長期，從接種后的第7天開始細胞的生長保持在一個比較平穩的狀態。所得結果顯示，24 h與48 h的OD值與0 h的OD值相比差異沒有統計學意義(P＞0.05);3～10 d，OD值結果與0 h組比較，差異有統計學意義 (P＜0.05)。根據此結果確定RAW264.7細胞在接種后的第48小時開始進入對數生長期，即視該時間段為干預細胞的最佳時期，可以較合理地觀察說明干預因素對細胞生長規律的影響。根據RAW264.7細胞生長規律隨時間的變化繪制出細胞生長曲線圖，見圖1。

圖1 MTT法繪制RAW 264.7細胞生長曲線Fig.1 Cell growth curve of RAW 2647 by MTT

2.2 MTT法確定羅勒提取物對正常RAW264.7細胞生長的影響

2.2.1 羅勒乙酸乙酯提取物對正常RAW264.7細胞生長的影響 在體外培養的小鼠腹腔巨噬細胞中加入終質量濃度為25、50、100、200、400μg/mL的羅勒乙酸乙酯提取物分別培養24、48、72、96 h后，可發現細胞的生長會受到不同的影響。結果表1。

表1 羅勒乙酸乙酯提取物在不同時間作用下對RAW 264.7細胞增殖的影響 (±s，n=3)Tab.1 Effect of Ocimum basilicum L．ethyl acetate extract on the proliferation of RAW 264.7 cells in the different time(±s，n=3)

表1 羅勒乙酸乙酯提取物在不同時間作用下對RAW 264.7細胞增殖的影響 (±s，n=3)Tab.1 Effect of Ocimum basilicum L．ethyl acetate extract on the proliferation of RAW 264.7 cells in the different time(±s，n=3)

注:與空白組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01

分 組OD值24 h 48 h 72 h 96 h空白組 0.296±0.053 0.381±0.033 0.389±0.019 0.466±0.019模型組 0.280±0.021 0.377±0.009 0.379±0.028 0.453±0.022羅勒乙酸乙酯提取物25 μg/L組 0.285±0.012 0.379±0.020 0.386±0.010＊＊## 0.371±0.018＊＊##羅勒乙酸乙酯提取物50 μg/L組 0.267±0.013*# 0.329±0.029＊＊## 0.369±0.021*# 0.299±0.011＊＊##羅勒乙酸乙酯提取物100 μg/L組 0.266±0.018*# 0.322±0.044＊＊## 0.365±0.017*# 0.284±0.019＊＊##羅勒乙酸乙酯提取物200 μg/L組 0.258±0.037*# 0.281±0.019＊＊## 0.310±0.023＊＊## 0.213±0.013＊＊##羅勒乙酸乙酯提取物400 μg/L組 0.062±0.011＊＊## 0.095 ±0.022＊＊## 0.048±0.025＊＊## 0.024±0.012＊＊##

除400μg/mL以外的其他劑量給藥組，在給藥后的72 h之前細胞的吸光度會一直升高，72 h之后會持續下降。組間分析結果表明，細胞的存活率隨著給藥質量濃度的增大而不斷降低，具有質量濃度依賴性。24 h時的IC50值為312.5μg/mL，給藥質量濃度為400μg/mL時，細胞存活率在20%以下，對RAW264.7細胞產生毒性作用。

2.2.2 羅勒正丁醇提取物對正常RAW264.7細胞生長的影響 在體外培養的小鼠腹腔巨噬細胞中加入終質量濃度為25、50、100、200、400μg/mL的羅勒正丁醇提取物分別培養24、48、72、96 h后，可發現細胞的生長會受到不同的影響。給藥后的24 h內，25、50μg/mL的藥物質量濃度對RAW264.7細胞具有促進增殖的作用，細胞存活率為106%、102%。結果如表2所示，在給藥后的72 h之前，各個給藥組細胞的吸光度持續升高，72 h之后反而下降。組間分析結果表明，細胞的存活率隨著給藥劑量的增大而不斷下降，具有一定的劑量依賴性。在24 h的IC50值為350.9μg/mL，達到400μg/mL時，對RAW264.7細胞產生毒性作用。

表2 羅勒正丁醇提取物在不同時間作用下對RAW 264.7細胞增殖的影響 (±s，n=3)Tab.2 Effect of Ocimum basilicum L．butanol acetate extract on the proliferation of RAW 264.7 cells in the different time(±s，n=3)

表2 羅勒正丁醇提取物在不同時間作用下對RAW 264.7細胞增殖的影響 (±s，n=3)Tab.2 Effect of Ocimum basilicum L．butanol acetate extract on the proliferation of RAW 264.7 cells in the different time(±s，n=3)

注:與空白組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01

分 組OD值24 h 48 h 72 h 96 h空白組 0.296±0.053 0.381±0.033 0.389±0.019 0.466±0.019模型組 0.280±0.021 0.377±0.009 0.379±0.028 0.453±0.022羅勒正丁醇提取物25 μg/mL組 0.313±0.014 0.375±0.016 0.377±0.012＊＊## 0.337±0.013＊＊##羅勒正丁醇提取物50 μg/mL組 0.302±0.019* 0.328±0.014＊＊## 0.363±0.012＊＊## 0.281±0.014＊＊##羅勒正丁醇提取物100 μg/mL組 0.287±0.009* 0.309±0.015＊＊## 0.357±0.032＊＊## 0.276±0.019＊＊##羅勒正丁醇提取物200 μg/mL組 0.219±0.013*# 0.277±0.019＊＊## 0.333±0.009＊＊## 0.261±0.010＊＊##羅勒正丁醇提取物400 μg/mL 組 0.128±0.007＊＊## 0.174 ±0.016＊＊## 0.192±0.011＊＊## 0.067±0.017＊＊##

2.3 羅勒有效提取物對經脂多糖刺激的RAW264.7細胞生長的影響 每個時間段的模型組與對應的空白組相比較，其差異具有統計學差異(P＜0.05)，說明細胞致炎成功。經脂多糖刺激的RAW264.7細胞受到各組藥物作用12 h后，各組藥物與模型組相比較，其差異無統計學意義 (P＞0.05)。24 h和48 h，除6.25μg/mL組外，其它給藥組與脂多糖組相比其差異具有統計學差異(P＜0.05)，對經脂多糖刺激的RAW264.7細胞均有增殖作用。結果見表3。

表3 羅勒提取物對經脂多糖刺激的RAW 264.7細胞的增殖作用 (±s，n=3)Tab.3 Proliferation to RAW 264.7 cells of polar extracts of Ocimum basilicum L．stimulated by lipopolysaccharide(±s，n=3)

表3 羅勒提取物對經脂多糖刺激的RAW 264.7細胞的增殖作用 (±s，n=3)Tab.3 Proliferation to RAW 264.7 cells of polar extracts of Ocimum basilicum L．stimulated by lipopolysaccharide(±s，n=3)

注:與空白組比較，#P ＜0.05，#P ＜0.01;與模型組相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

分 組 劑量12 h 24 h 48 h空白組 －0.682±0.471 0.729±0.056 0.889±0.071模型組 1.00μg/mL 0.307±0.109# 0.223±0.057## 0.076±0.001##吲哚美辛 10－7 mol/L 0.531±0.037 0.597±0.022＊＊ 0.623±0.012＊＊陽性對照組 10－4 mol/L 0.496±0.023 0.538±0.045＊＊ 0.551±0.031＊＊羅勒乙酸乙酯提取物 6.25μg/mL 0.356±0.092 0.335±0.015 0.303±0.044＊＊羅勒乙酸乙酯提取物 12.50μg/mL 0.374±0.026 0.384±0.003＊＊ 0.650±0.158＊＊羅勒乙酸乙酯提取物 25.00μg/mL 0.456±0.174 0.552±0.137＊＊ 0.667±0.114＊＊羅勒乙酸乙酯提取物 50.00μg/mL 0.545±0.099 0.631±0.048＊＊ 0.724±0.077＊＊羅勒乙酸乙酯提取物 100.00μg/mL 0.555±0.015 0.636±0.036＊＊ 0.784±0.091＊＊羅勒正丁醇提取物 6.25μg/mL 0.487±0.211 0.273±0.011 0.183±0.011羅勒正丁醇提取物 12.50μg/mL 0.528±0.233 0.501±0.042＊＊ 0.414±0.001＊＊羅勒正丁醇提取物 25.00μg/mL 0.496±0.079 0.526±0.132＊＊ 0.537±0.131＊＊羅勒正丁醇提取物 50.00μg/mL 0.522±0.109 0.574±0.041＊＊ 0.617±0.014＊＊羅勒正丁醇提取物 100.00μg/mL 0.525±0.072 0.619±0.151＊＊ 0.676±0.019＊＊

2.4 羅勒有效提取物在體外對5-脂氧酶活性的影響 由表4得出，模型組與空白組比較，差異具有統計學意義 (P＜0.01)，證明細胞模型建造成功。各藥組與模型組相比，差異具有統計學意義 (P＜0.01)，可以判斷羅勒乙酸乙酯提取物和羅勒正丁醇提取物均對白三烯B4均有抑制作用，羅勒乙酸乙酯提取物的抑制作用大于羅勒正丁醇提取物。而對白三烯B4的抑制作用隨著給藥劑量的提高逐漸增大，存在著一定的量效關系。可見，羅勒提取物對5-脂氧酶的活性有抑制作用。

3 討論

確定有效給藥劑量是進行藥物干預實驗之前的非常重要的試驗步驟。本研究首先通過維藥羅勒不同提取物對正常RAW264.7細胞的干預實驗，確定了不同質量濃度的維藥羅勒乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物對正常RAW264.7細胞有不同的影響，而羅勒乙酸乙酯提取物對細胞增殖的影響大于羅勒正丁醇提取物，400μg/mL的羅勒乙酸乙酯提取物對RAW264.7細胞的毒性大于相同質量濃度的羅勒正丁醇提取物，倆者均降低了細胞的存活率。顯微鏡下觀察發現，藥物質量濃度達到400μg/mL時，細胞的形態出現明顯的損傷現象 (細胞體積縮小，突起消失，間隙增大)，這可能與巨噬細胞吞噬了大量的脂質后轉變為泡沫細胞，從而加重細胞的損傷有關［10］。因此在進行藥效學實驗時，將此質量濃度排除在外。在相同的時間段內，羅勒乙酸乙酯提取物和羅勒正丁醇提取物均隨著質量濃度的增大，其對細胞的毒性也逐漸增大。可以推斷羅勒提取物質量濃度與其對細胞的毒性作用之間有著一定的量效關系。

表4 羅勒不同提取物對5-脂氧酶活性的影響 (±s，n=3)Tab.4 Effects on 5-lipoxygenase enzyme activity of different extracts of Ocimum basilicum L．(±s，n=3)

表4 羅勒不同提取物對5-脂氧酶活性的影響 (±s，n=3)Tab.4 Effects on 5-lipoxygenase enzyme activity of different extracts of Ocimum basilicum L．(±s，n=3)

注:與空白組比較，#P＜0.05;與模型組相比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與羅勒乙酸乙酯比較，+P＜0.01

分 組 劑 量 白三烯B4質量濃度/(ng·L－1)抑制率/%空白組 － 121.69±5.48 －模型組 1μg/mL 293.45±7.41## －陽性對照組 100μmol/L 133.24±4.46＊＊ 54.59羅勒乙酸乙酯提取物 100μg/mL 167.91±23.99＊＊ 42.78羅勒乙酸乙酯提取物 50μg/mL 174.04±16.91＊＊ 40.69羅勒乙酸乙酯提取物 25μg/mL 186.83±3.38＊＊ 36.33羅勒正丁醇提取物 100 μg/mL 180.08±15.25＊＊+ 38.63羅勒正丁醇提取物 50 μg/mL 181.89±13.46＊＊+ 38.02羅勒正丁醇提取物 25 μg/mL 215.71±30.32＊＊+26.49

在進行檢測炎癥因子水平之前，需要考慮維藥羅勒提取物對被脂多糖刺激致炎后的RAW264.7細胞會有什么樣的影響并且確定其給藥劑量。脂多糖是一種重要的致病介質，來源于革蘭氏陰性細菌細胞壁。根據進入機體的劑量不同，會引起不同程度的炎癥和中毒反應［11-12］。脂多糖對天然免疫細胞表達細胞因子的調節作用是脂多糖致病的核心機制［13］。本實驗所采用的小鼠腹腔巨噬細胞屬免疫細胞，當被脂多糖刺激之后，細胞的生理環境將會發生變化，細胞的存活率也將隨之下降。結合以上MTT實驗結果，選定安全劑量范圍，對脂多糖刺激后的細胞進行了試驗觀察，發現羅勒提取物對經脂多糖刺激后的細胞有增殖作用，這可能與其抑制了脂多糖所致的炎癥因子有關。

多不飽和脂肪酸花生四烯酸 (arachidonic acid)是多種生物活性物質的前提，作為一種重要的人體必需脂肪酸，它具有重要的生理，病理作用。花生四烯酸代謝網絡是炎癥代謝網絡中的一個核心網絡［14］。人體的花王四烯酸代謝網絡中，主要有兩條代謝路徑:①通過環氧酶 (cyclooxygenase，COX)的作用生成各種前列腺素 (prostaglandins，PGs);②通過脂氧酶 (5-lipoxygenase)的作用生成白三烯 (leukotrienes)，脂質過氧化物［15］，這些代謝產物可能引起或加重機體的一些炎癥反應。現有研究證明，生物組織細胞膜富含的花生四烯酸經專一酶催化產生的代謝物除了調控許多生理過程外，還在炎癥反應中起重要作用［16］。

脂氧合酶 (Lipoxygenase，LOX)是一種氧合酶，作為一種含非血紅素鐵的蛋白，其代謝產物白三烯類物質是一種強烈的炎癥介質，對哮喘、類風濕、過敏性鼻炎及癌癥等常見多發病的發生發展起到很大的作用。通過檢測羅勒提取物對5-脂氧酶代謝產物白三烯B4的影響發現，給藥組的存活率明顯高于模型組。這是因為羅勒提取物抑制了5-脂氧酶活性，炎癥因子白三烯B4的釋放受到限制。羅勒乙酸乙酯提取物對5-脂氧酶代謝產物白三烯B4的抑制率明顯大于羅勒正丁醇提取物，羅勒乙酸乙酯提取物可能是羅勒發揮抗炎作用的有效部位。

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