莪術油對人卵巢癌SKOV3細胞的影響及鉑類耐藥逆轉作用

李艷芳， 李 敏， 劉首娟， 孔德勝， 李榮霞， 史淑紅

(河北醫科大學第二醫院婦科，河北石家莊050000)

中西醫結合防治腫瘤是我國治療疾病的一大特色。近年來天然、低毒的中草藥也受到了國際上的關注［1-2］，莪術油是中藥莪術的主要提取物，近年來國內外通過現代藥理學研究發現莪術油具有多種藥理作用，因而備受關注。隨著現代藥理研究的深入和各種制劑［3-4］的開發，莪術油在抗病毒方面［5-6］、免疫調節［7］、抗腫瘤方面［8-9］研究日益增多。在婦科方面，眾所周知的莪術油制劑保婦康栓廣泛應用于臨床，其療效也得到臨床的肯定。在科學研究中也有學者發現莪術油對宮頸癌細胞［8］、子宮內膜癌細胞［9］有明顯的抑制作用，但是在在卵巢癌方面，尤其是在卵巢癌鉑類耐藥方面仍未見報道。

1 材料

人卵巢上皮癌細胞系SKOV3:由河北醫科大學第四醫院腫瘤研究所提供。人卵巢上皮癌順鉑耐藥細胞系SKOV3/DDP:購買于中國科學院腫瘤研究所。莪術油注射液:徐州萊恩藥業有限公司，規格:10 mL含莪術油0.1 g，國藥準字H20067076。注射用順鉑 :齊魯制藥有限公司，規格:10 mg，國藥準字H37021358。

2 方法

2.1 細胞培養 人卵巢上皮癌細胞株SKOV3及順鉑耐藥細胞株SKOV3/DDP均于含10%胎牛血清(四季青無支原體優級胎牛血清，浙江天杭生物科技有限公司)的RPMI 1640培養液 (GIBCO上海英俊生物有限公司)進行培養，培養環境為37℃、5%CO2與相對飽和濕度。

2.2 MTT法測定莪術油對細胞增殖的抑制作用取對數生長期的SKOV3細胞，以每孔約9×103細胞接種于96孔培養板，每孔終體積為180μL加入不同質量濃度的莪術油注射液20μL，終質量濃度60、55、50、45、40、35、30 μg/mL，每個質量濃度設6個復孔，分別培養24 h、48 h后每孔避光加入20μL 5 mg/mL MTT溶液 (美國Sigma公司)繼續培養4 h，小心吸棄孔內培養液，每孔加入150 mL DMSO(美國 Sigma公司)，輕微震蕩10 min，待紫色結晶充分溶解，于490 nm波長處分別測定吸光度OD值。按下列公式求出生長抑制率(IR)。并計算半數抑制濃度 (IC50)。細胞生長抑制率 =(1－實驗組平均OD值/對照組平均OD值)×100%

2.3 流式細胞技術檢測莪術油對細胞周期的影響

流式細胞技術檢測莪術油對細胞周期的影響。對數生長期的SKOV3細胞，常規消化制備單細胞懸液，以每瓶1×106個細胞接種于新的細胞培養瓶中，待細胞生長同步后，吸去原培養液，加入含有莪術油的培養液4 mL，其中莪術油的濃度為其對SKOV3細胞的IC50，設空白對照組，于37℃，5%CO2培養箱中培養24 h和48 h終止培養，收集細胞，70%冰乙醇固定，核糖核酸酶A(RnaseA，美國Sigma公司)處理，碘化丙啶 (PI，美國Sigma公司)避光染色60 min，經200目尼龍網過濾后，流式細胞儀 (美國Beckmancouler-EPICSL)檢測細胞周期。采用增殖指數來表示細胞增殖狀態，即(S+G2)期的細胞數/總的細胞數。

2.4 莪術油對SKOV3/DDP細胞順鉑耐藥的逆轉作用

2.4.1 順鉑對人卵巢癌順鉑敏感細胞株的IC50取對數生長期的SKOV3細胞，以每孔約9×103細胞接種于96孔培養板，每孔終體積為180μL加入不同質量濃度的用含10%胎牛血清的完全培養液稀釋的順鉑20μL，終質量濃度10、8、6、4、2、1μg/mL，每個質量濃度設6個復孔，培養48 h后每孔避光加入MTT溶液，繼續培養4 h棄上清，加用DMSO，溶解紫色結晶，于490 nm波長測定吸光度OD值。計算生長抑制率 (IR)及IC50(具體同2.2項)。

2.4.2 2×2析因設計觀察莪術油對SKOV3/DDP細胞株順鉑耐藥性的影響。析因設計的兩因素:敏感細胞株SKOV3的莪術油IC50;敏感細胞株SKOV3的順鉑IC50。兩水平為有及無。實驗具體分組如表1所示。

表1 析因設計分組Tab.1 Groups of experiment

2.5 數據處理 采用SPSS 17.0統計軟件包進行處理，統計描述采用均數±標準差或中位數 (四分位間距)表示，采用曲線擬合計算半數抑制濃度，細胞周期率的比較采用卡方檢驗，析因設計采用析因設計的方差分析。

3 結果

3.1 莪術油對人卵巢癌SKOV3細胞的增殖抑制作用 倒置顯微鏡觀察實驗組的細胞，貼壁細胞較對照組減少，邊緣毛糙，不規則，胞質顆粒感增強。隨著莪術油質量濃度的增加，變化越明顯。48 h組較24 h組更明顯。

MTT比色結果顯示，莪術油注射液對人卵巢上皮癌細胞的增殖具有明顯的抑制作用，抑制率呈濃度和時間依賴性。抑制率隨著莪術油質量濃度的增高而增加，作用時間48 h較24 h對細胞的抑制程度大。據莪術油質量濃度對48 h抑制率作圖，符合二次回歸變化規律，R2=0.995，F=428.860，P＜0.01，曲線方程為 Y^=－2.443+0.121X－0.001X2計算莪術油對人卵巢癌SKOV3細胞的半數抑制濃度IC50為33.71μg/mL。

3.2 莪術油對卵巢癌SKOV3細胞周期的影響 實驗結果顯示無論是莪術油作用24 h，還是48 h，周期中各個時相的構成較對照組均有明顯的變化。24 h組對照組G1期細胞比例為32.7%，而實驗組經莪術油作用后增加至47.9%，相反S期細胞對照組51.8%降至32.5%，差別有統計學意義 (x2=367.002，P＜0.01)。48 h組變化趨勢于24 h組一致，即莪術油可以使SKOV3細胞G1期比例增加，而下調S期細胞比例，即莪術油可以將人卵巢癌SKOV3細胞阻滯于G0/G1期。但是24 h組和48 h組差別無顯著性。

增殖指數即S+G2期細胞的百分比，24 h組及48 h組均與對照組有明顯差別 (如表2)，此結果也說明了莪術油對SKOV3細胞的增殖有顯著的抑制作用。

表2 莪術油對SKOV3細胞增殖指數的影響Tab.2 Comparison of prdiferation index between G1 phase and(S+G2)phase in SKOV3 cell

3.3 莪術油對SKOV3/DDP細胞順鉑耐藥的逆轉作用

3.3.1 順鉑對SKOV3/DDP細胞的IC50MTT比色法測得順鉑對SKOV3細胞系增殖抑制率隨順鉑質量濃度的增加而增加，根據雙變量相關性分析，順鉑對SKOV3細胞的抑制作用呈現對數函數關系(R2=0.961，F=99.672，P ＜0.01，Y^=13.169+34.921ln X)。計算 IC50為2.87μg/mL。

3.3.2 莪術油對SKOV3/DDP細胞株順鉑耐藥性的影響 各試驗組對SKOV3細胞的抑制率如表3所示，A組為66.01%，B組為3.74%，C組為49.75%，D組為0，差別具有顯著性，即A、B、C、D各組細胞的增殖狀態不全相同，(F=47.054，P＜0.01)。

表3 四組之間抑制率的比較Tab.3 Comprison of inhibition rate among four groups

析因設計的方差分析結果顯示，莪術油的主效應 (F=422.410，P＜0.01)、順鉑的主效應(F=13.470，P＜0.01)及二者的交互效應 (F=5.283，P＜0.05)，即莪術油、順鉑均可抑制SKOV3細胞的增殖，二者合用對細胞生長的抑制有協同作用，莪術油可以增加耐藥細胞對順鉑的敏感性，交互作用圖見圖1所示，二者呈相交直線關系。

圖1 莪術油、順鉑交互作用圖Fig.1 Interactions plot of zedoary oil and cisplatin

4 討論

4.1 對人卵巢癌SKOV3細胞增殖的抑制作用 中西醫結合防治腫瘤是我國的特色之一，高效、低毒的天然中草藥越來越受到國內外學者的青睞。莪術為姜科植物溫郁金Curcuma wenyujin Y．H．Chen et C．Ling的干燥根莖，性溫，味苦、辛，有破血祛瘀、行氣止痛之功效［10］。莪術油為莪術的非極性溶劑提取物所含的揮發油，其成分復雜，主要含有多種低沸點的倍半萜和單萜化合物［11］。近年國內外通過藥理學研究發現它是安全性很高的藥物，且具有藥理活性強、高效性等特點［12］，具有廣譜的抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗凝血和抗氧化的活性［13］，其中抗腫瘤是莪術油最主要的藥理作用，對各細胞周期都有抑制作用［14-15］。這一點已經在肝癌、肺癌、乳腺癌、宮頸癌、鼻咽癌中得到證實。

本實驗結果表明莪術油對卵巢癌細胞的體外增殖有明顯的抑制作用，其抑制作用呈質量濃度依賴性，這一結論與楊美春等［16］報道一致。從實驗結果可以看出，莪術油對人卵巢癌SKOV3細胞的抑制作用隨莪術油質量濃度的增加呈陡增性，莪術油質量濃度為30μg/mL時其抑制率為20%左右，但是質量濃度為40μg/mL其抑制率接近70%。經計算得出莪術油對卵巢癌SKOV3細胞的半數抑制質量濃度34μg/mL。

4.2 流式細胞技術檢測莪術油對人SKOV3細胞周期的影響 細胞周期一般分為G0、G1、S、G2、M時期，DNA的量也隨各時相呈現出周期性的變化。流式細胞技術分析細胞周期是依據細胞DNA量來分析的。抗腫瘤藥物常通過抑制腫瘤細胞DNA的合成而發揮其抗腫瘤作用，它可以影響DNA合成過程的任何階段，受損的DNA常被阻滯在G1期而不進入S期復制;或者被阻滯在G2期，從而阻斷其進入M期進行異常的有絲分裂［17］，長期的臨床實踐及實驗研究中，人們已經發現抗腫瘤藥物與中藥聯合應用提高臨床療效，但對其機制的了解還不夠深入［18-20］。

本研究結果顯示經莪術油作用后，SKOV3細胞周期中各個時相的細胞所占的比例較對照組有明顯的變化，表現為G1期細胞比例均較對照組明顯增加，相應的S期、G2期細胞比例明顯減少，差異有統計學意義，細胞周期呈明顯G1期阻滯狀態，也就是說莪術油可以將人卵巢上皮性惡性腫瘤SKOV3細胞阻滯在G0/G1期，從而阻斷細胞周期，抑制細胞的增殖。增殖指數即S+G2期細胞的百分比，實驗結果顯示莪術油組明顯低于對照組(P＜0.01)，莪術油組的SKOV3細胞的增殖能力顯著低于對照組，進一步證實了莪術油對人卵巢上皮性惡性腫瘤SKOV3細胞的增殖有顯著的抑制作用。

本實驗莪術油對SKOV3細胞周期的影響，在其作用24 h和48 h后差別不大，而本實驗中為了滿足流式細胞儀檢測樣本需要的細胞數，細胞培養的時候接種的細胞數量比較多，不排除在第二個24 h時，細胞數量已經很多，細胞營養相對不足，增殖能力下降的可能，從而不符合一般的生長曲線。這一現象有待進一步證明。

4.3 SKOV3/DDP細胞株順鉑耐藥性的影響 腫瘤細胞多藥耐藥性的產生是卵巢癌復發、未控、轉移的主要原因，其產生機制相當復雜，多年來的研究也未能完全闡明。細胞耐藥性的產生往往是多種機制共同參與，但是多年來對于多藥耐藥性的研究始終沒有找到滿意的藥物可以逆轉化療藥物的耐藥性。第一代MDR逆轉劑如鈣調節劑維拉帕米，可以通過競爭P-gp的結合位點從而增加藥物的敏感性，但是在體內必須需要足夠的濃度才可以逆轉耐藥，這個濃度已經超過了維拉帕米在體內產生毒性的最小劑量，從而限制了其使用。第二代MDR逆轉劑由于干擾抗腫瘤藥物的藥代動力學也限制了使用［21］。由于耐藥機制的復雜性和多元性，化學藥物只能針對其中一種耐藥機制進行逆轉，而祖國的傳統中藥本身成分復雜，其治療腫瘤的特點也就具有多靶點、多層次、綜合調節的特點，目前越來越多的學者目光轉向中草藥，并且已有研究表明許多中醫藥對耐藥細胞的凋亡有誘導作用，在中藥中篩選低毒、高效的耐藥逆轉劑將成為腫瘤MDR逆轉劑研究的一個新的方向［22-23］。李娟［24］的研究中也證實大黃素通過降低MDR-1、XIAP和Survivin的表達從而增加卵巢癌細胞對紫杉醇的藥物敏感性，促進細胞凋亡。本研究采用2×2析因設計的實驗分組，分析了莪術油和順鉑聯合應用之間的交互作用，結果表明二者合用對人卵巢癌順鉑耐藥細胞SKOV3/DDP的抑制作用存在交互作用，順鉑與莪術油合用可以增加二者對SKOV3/DDP細胞的抑制作用，由此可以認為，莪術油可以增加細胞對順鉑的敏感性，換言之，莪術油在一定程度上可以改善人卵巢癌SKOV3/DDP細胞株的順鉑抗藥性。但是關于莪術油在逆轉耐藥方面的作用機制，還有待進一步研究。

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