小白杏杏仁油免疫調節及對S180肉瘤抑制作用研究

田洪磊 張 灝 田豐偉

(食品科學與技術國家重點實驗室江南大學食品學院1，無錫 214122)

(石河子大學食品學院2，石河子 832000)

新疆小白杏屬薔薇科李屬(Rosaceaa，Prunus)，其杏仁油制品是新疆少數民族居民長期食用的特色藥食兩用資源，其中主要含有多種不飽和脂肪酸、植物甾醇、維生素E等，新疆維吾爾民族普遍將小白杏杏仁油作營養滋補品，也是一種維吾爾藥物，除了具有補腦安神、益腎生精、抗突變等作用外，在免疫調節和抗腫瘤方面的作用受到疆內外醫藥領域廣泛關注［1－2］。目前新疆小白杏仁油的免疫調節及抗腫瘤作用的研究尚未見報道。本試驗在建立免疫力低下試驗大鼠模型的基礎上，研究明晰新疆小白杏杏仁油的免疫調節作用，并對體外培養的S180肉瘤細胞的抑制作用進行了初步探討，以期為深入解析小白杏杏仁油免疫調節與抗腫瘤作用的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗樣本與試劑

小白杏杏仁油由石河子大學農產品加工與貯藏重點實驗室制備提供;注射用環磷酰胺:上海華聯制藥有限公司;S180細胞株由石河子大學醫學院藥理基礎實驗室提供;大鼠血液免疫因子檢測試劑盒:南京建成生物工程研究所;MTT生化試劑:美國Sigma公司;RPMI1640試劑:美國GIBCO公司;胎牛血清:杭州四季青生物材料研究所;其他試劑均為分析純。

1.1.2 試驗動物與飼養條件

SPF級雄性昆明種大鼠60只，由新疆醫科大學第一附屬醫院動物實驗中心提供［動物生產許可證號:SCXY(新)2011－0004］;動物飼養在新疆醫科大學第一附屬醫院動物實驗中心動物飼養房［許可證號:SYXK(新)2010－0003］內進行，采用籠具飼養的方法，環境溫度為22～25℃，濕度為50%～65%，自然光照(12 h/d)，自由進食飲水［3－4］，適應性喂養7 d后，開始正式試驗。

1.1.3 試驗儀器與設備

HA121－50－02型超臨界萃取設備:江蘇華安科技股份有限公司;Multifuge X3R臺式冷凍離心機:美國Thermo scientific公司;MCO－15AC型CO2培養箱:上海華耀貿易有限公司;96孔細胞培養板:丹麥NUNC公司;TS100/100－F型倒置顯微鏡:尼康儀器上海有限公司;XG－VS超凈工作臺:江陰市凈化設備廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 小白杏杏仁油制備方法

從新疆輪臺縣小白杏種植示范園區采集成熟的小白杏鮮杏，整理收集小白杏杏仁，清水處理后進行烘箱干燥［干燥溫度(50±2)℃］，并將其粉碎至30目;在萃取溫度為35℃、萃取壓力為30 MPa、CO2流速為18 L/h的條件下萃取3 h進行小白杏杏仁油樣品制備，并采用課題組前期建立的氣相色譜－質譜(GC－MS)檢測方法［5］，對其脂肪酸組成進行了分析，分析結果如表1所示。

表1 新疆小白杏杏仁油超臨界CO2萃取樣品的脂肪酸組成

制備樣品－20℃條件下貯存為后期動物試驗備用，并經新疆醫科大學第一附屬醫院動物實驗中心動物實驗倫理委員會審核批準，設計本次研究方案及操作流程。

1.2.2 動物模型建立與分組

采用環磷酰胺誘導的方法建立免疫力低下大鼠模型，將環磷酰胺干粉配成4 mg/mL的生理鹽水溶液，按照40 mg/kg標準對大鼠進行腹腔注射，每周各間隔2 d注射2次即可建模，為維持免疫力低下狀態，灌服對照喂養階段繼續每周2次注射環磷酰胺，直至本項研究結束［6－8］;試驗起始首先按上述方法建立免疫力低下大鼠模型后，將試驗大鼠隨機分成3組(正常大鼠空白對照組、大鼠模型對照組及大鼠模型樣品喂養組)，每組各20只，其中樣品喂養組每日按5 mL/100 g灌胃，其他兩組按相同體積生理鹽水灌胃對照，喂養28 d后采集檢測樣本。

1.2.3 大鼠免疫器官指數測定

末次灌胃24 h后稱重，乙醚麻醉試驗大鼠，迅速取出脾臟、胸腺及肝臟，用濾紙吸干血跡后稱重，按如下方式計算臟器指數(mg/g):臟器指數=臟器質量/體質量［9－11］。

1.2.4 大鼠血清免疫調節因子檢測

采用心臟取血－抗凝儲存的方法制備各組血漿樣品，在0℃條件下離心分離(3 000 r/min)10 min，獲得待檢血清，采用酶聯免疫吸附法(ELIAS)，按試劑盒說明書方法檢測大鼠血清中IgA、IgM、IgG、IL－2、IL－12及 TNF －α 的表達水平［12－13］。

1.2.5 S180細胞的培養

在蒸餾水中加入胎牛血清(FBS)配制濃度為10 ml/L的S180細胞培養液(RPMI1640)，并分別加入青霉素100 U/mL和鏈霉素100 μg/mL進行壓濾除菌;在37℃、5%CO2培養箱中進行細胞培養，通過MTT檢測取呈對數生長的濃度為1×105個/mL的S180細胞懸液，于96孔培養板鋪板，每孔加入細胞懸浮液200 μL，用200 μL 50%小白杏仁油的四氫呋喃(≤0.5%)溶液作用于 S180細胞，并做陰性對照，于37℃、5%CO2培養箱培養48 h，倒置顯微鏡下觀察 S180細胞細胞形態并拍照(放大400倍)［14－16］。

1.3 統計學分析

試驗數據處理均采用SPSS 20.0軟件處理，所有數據均進行3次平行試驗，并進行t檢驗，試驗數據結果以均數±標準差(±SD)表示，P＜0.05表示有顯著性差異，P＜0.01表示有較顯著性差異，P＜0.001表示有極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 新疆小白杏杏仁油對環磷酰胺誘導的免疫力低下大鼠生長的影響

動物試驗開始首先建立各對照組生長狀況檔案，在每周周末清晨稱重，并統計1周的采食量，計算對照組體重平均值及平均采食量，統計結果如表2所示。

表2 新疆小白杏杏仁油對環磷酰胺誘導的免疫力低下大鼠體重和采食量的影響

根據表2統計數據分析，試驗期間各對照組試驗大鼠體重呈現差異性變化，其中正常大鼠空白對照組(BS)平均體重增長速度最快，大鼠模型對照組(MC)增長最為緩慢，與正常大鼠空白對照組(BS)相比呈顯著性(P＜0.05)減重趨勢;大鼠模型樣品喂養組(SF)平均體重增長速度較快，與大鼠模型對照組(MC)相比呈顯著性(P＜0.05)增重趨勢。差異的飼養方式同樣導致對照組試驗大鼠的平均采食改變，大鼠模型樣品喂養組(SF)的采食量明顯(P＜0.05)低于大鼠模型對照組(MC)的采食量，說明小白杏杏仁油在降低動物的基礎采食量情況下，可能由于改善了免疫力低下模型大鼠的免疫表達系統而努力維持了機體的生理功能。

2.2 新疆小白杏杏仁油對環磷酰胺誘導的免疫力低下大鼠免疫臟器指數的影響

按照1.2.2節方法分組試驗，對照飼養結束后采用乙醚麻醉進行心臟取血(用于后期血清免疫因子檢測)，并取出脾臟、胸腺及肝臟稱重，計算免疫器官指數，結果如表3所示。

表3 新疆小白杏杏仁油對環磷酰胺誘導的免疫力低下大鼠免疫臟器指數影響

由表3試驗結果所示，與正常大鼠空白對照組(BS)相比，大鼠模型對照組(MC)胸腺指數(P＜0.01)、脾臟指數(P ＜0.001)及肝臟指數(P ＜0.05)顯著降低，差異結果具有統計學意義;與大鼠模型對照組(MC)比較，大鼠模型樣品喂養組(SF)脾臟指數(P ＜0.01)、胸腺指數(P ＜0.01)及肝臟(P ＜0.05)均具有明顯增加，顯現出可靠的統計學意義。說明采用此方法可以造就大鼠免疫力低下模型，且新疆小白杏杏仁油對機體免疫器官具有增值的作用。

2.3 新疆小白杏杏仁油對環磷酰胺誘導的免疫力低下大鼠血清免疫因子的調節作用

采用酶聯免疫吸附法(ELIAS)研究新疆小白杏杏仁油對大鼠血清免疫因子的調節作用，按試劑盒說明書方法檢測大鼠血清中相關免疫因子的表達水平，結果如圖1、圖2所示。

從圖1、圖2可以看出，模型對照組(MC)與空白對照組(BS)相比較，大鼠血清免疫球蛋白(IgA、IgM、IgG)及其他免疫因子(IL－2、IL－12、TNF－α)含量明顯降低，其中模型組中IgA與IgM的差異表達呈現極顯著的水平(P ＜0.001)，IgG、IL－2、IL－12及TNF－α的差異表達呈現較顯著水平(P＜0.01)，差異具有統計學意義，可以說明采用此種方法已成功建立免疫力低下大鼠模型;樣品喂養的模型組(SF)與模型組比均有不同程度的提高，其中小白杏杏仁油對IgA、IgM、IgG及IL－12指標的改善程度達到較顯著差異水平(P＜0.01)，唯有IL－2和TNF－α指標的改善程度相對較低，但也呈現顯著差異水平(P＜0.05)，以上結果提示新疆小白杏杏仁油對環磷酰胺誘導的免疫力低下大鼠具有明顯的免疫調節作用。

2.4 新疆小白杏杏仁油對S180肉瘤體外抑制作用

用200 μL 50%小白杏仁油的四氫呋喃(≤0.5%)溶液及相同體積四氫呋喃(≤0.5%)溶液分別作用于S180細胞的試驗組和陰性對照組，結果如圖3、圖4所示。

觀察結果表明，添加小白杏杏仁油試驗組與其陰性對照組相比，細胞數量明顯減少，初步說明新疆小白杏杏仁油具有抑制S180細胞生長的作用，其抑制作用機制有待通過S180肉瘤大鼠模型進一步深入研究。

3 討論與結論

本試驗采用環磷酰胺誘導腹腔注射及S180肉瘤細胞體外培養觀察的方法研究了新疆小白杏杏仁油免疫調節及抑制腫瘤細胞生長的作用，試驗結果表明新疆小白杏杏仁油對免疫力低下大鼠模型的脾臟、胸腺及肝臟等機體免疫器官具有增殖的作用，而且能夠提升大鼠血清免疫球蛋白(IgA、IgM、IgG)及其他免疫因子(IL－2、IL－12、TNF－α)的表達，其中小白杏杏仁油對IgA、IgM、IgG及IL－12指標的改善程度達到較顯著差異水平(P＜0.01);通過體外細胞培養觀察新疆小白杏杏仁油具有抑制S180細胞生長的作用，為深入解析小白杏杏仁油免疫調節與抗腫瘤作用的分子機制奠定基礎。

小白杏杏仁油的免疫調節作用及對S180肉瘤細胞的抑制作用可能與其所含的營養成分有關，尤其是多種不飽和脂肪酸與各項免疫因子之間可能存在差異性的構效關系。在增強膜的流動性的前提下特異不飽和脂肪酸能夠增強巨噬細胞的吞噬能力，與此同時降低膜的脂質過氧化程度，從而改善機體免疫因子的表達水平［17－18］。Wooki等［19］的研究也表明多不飽和脂肪酸通過抑制機體炎癥因子表達而對免疫細胞功能產生影響。在此期間不排除協同調節作用方式的可能，不飽和脂肪酸首先與相應靶細胞膜上的受體結合，并以信號傳遞分子的形式，通過細胞表達因子介導和調節機體免疫應答［20］。因此，機體免疫應答的產生及細胞因子的相互作用與平衡構成了復雜的網絡體系。有關新疆小白杏杏仁油的免疫調節及對S180肉瘤細胞抑制的作用機制目前尚未完全清楚，不飽和脂肪酸單體或體系是否與某些細胞因子之間存在某種特殊的構效關系或協同關系有待進一步研究，為明確小白杏杏仁油的的免疫調節及抑制腫瘤細胞生長的功效因子及其作用機制，課題組將以已建立的小白杏杏仁油活性物質指紋圖譜庫為基礎，并結合相關數學模型深入研究其構效相關性，為新疆小白杏種植資源改良及產品升級奠定良好的理論基礎。

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