氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定14種食用植物油中的植物甾醇

楊春英 劉學(xué)銘 陳智毅 楊榮玲 林耀盛 趙曉麗

(廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工公共實(shí)驗(yàn)室廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所，廣州 510610)

植物甾醇(Phytosterol，plant sterol)是一種天然的植物活性物質(zhì)，廣泛存在于各種植物油、種子和堅(jiān)果中，也存在于部分蔬菜水果中［1］。植物甾醇的結(jié)構(gòu)與膽固醇相似［2］，為環(huán)戊全氫菲的3－羥基化合物，C－5上有雙鍵的稱甾醇，C－5飽和的稱甾烷醇。常見4種植物甾醇為豆甾醇、β－谷甾醇、菜籽甾醇和菜油甾醇，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。四種甾醇的區(qū)別在于支鏈大小和雙鍵數(shù)目不同。

圖1 4種植物甾醇結(jié)構(gòu)式

研究證明，植物甾醇具有降血脂［3－4］、防治前列腺肥大、抗腫瘤、類激素、提高免疫力等多種生理功能［5］，在西方很多國(guó)家將其應(yīng)用于人群慢性病預(yù)防。近20年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者日益重視植物甾醇的研究，開展了食物中植物甾醇的含量測(cè)定及功能評(píng)價(jià)工作，并將其作為功能食品的一種添加劑［6－7］。傳統(tǒng)測(cè)定植物甾醇的方法如重量法、比色法及酶法等，只能測(cè)定甾醇總量，不能實(shí)現(xiàn)對(duì)具體某一甾醇進(jìn)行定性和定量分析［8］;近年報(bào)道的方法主要有薄層色譜法［9］(TLC)、高效液相色譜法［10］(HPLC)、氣相色譜法［11］(GC)和氣相色譜 － 質(zhì)譜法［12］(GC － MS)等。由于GC法具有快速簡(jiǎn)便、靈敏度高和分離效果好等優(yōu)點(diǎn)，再加上MS的定性效果較好，故本試驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了食用植物油中甾醇測(cè)定的GCMS法，樣品皂化后無需衍生，可直接進(jìn)樣分析。同時(shí)對(duì)14種食用植物油的4種植物甾醇含量進(jìn)行了分析，為合理選用食用油和食用油品質(zhì)評(píng)價(jià)提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油茶籽油、花生油、葡萄籽油、芝麻油、大豆油、菜籽油、玉米油、葵花籽油、橄欖油、花椒籽油、辣椒油、芥末油、姜油和大蒜油:市售，其中，花椒籽油、辣椒油、芥末油、姜油和大蒜油均為以植物油為基礎(chǔ)添加辛香料的調(diào)味油。

豆甾醇、β－谷甾醇、菜籽甾醇和菜油甾醇標(biāo)準(zhǔn)品:美國(guó)Chromadex公司;色譜純無水乙醇，優(yōu)級(jí)純氫氧化鉀和無水硫酸鈉，其余試劑均為分析純，所用水為超純水。

6890N/5975B氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀:美國(guó)Agilent Technologies有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 分析條件

1.2.1.1 氣相色譜條件

色譜柱:J＆W DB－5MS UI毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm);進(jìn)樣口溫度:300 ℃;進(jìn)樣量:1.0 μL，分流比為 20∶1;載氣:高純氦氣，流速為 1.0 mL/min;程序升溫:初始溫度180℃，以15℃/min升溫速率升至280℃，保持25 min。

1.2.1.2 質(zhì)譜條件

EI離子源，電子能量70 eV;離子源溫度230℃;四極桿溫度計(jì)150℃;傳輸線溫度280℃;質(zhì)量范圍30～550 amu，全掃描方式;溶劑延遲2 min。

1.2.2 樣品處理

準(zhǔn)確稱取2.000 0 g植物油于100 mL具塞三角瓶中，分別加入30 mL無水乙醇，2.5 mL 20% 抗壞血酸溶液，3.00 mL50%氫氧化鉀溶液，置80℃水浴邊加熱邊震蕩40 min使其皂化，皂化完全后立即將皂化試液放入冰水浴中冷卻。將皂化試液轉(zhuǎn)移至250 mL分液漏斗中，用40 mL超純水分3次洗滌皂化用的三角瓶，洗液并入分液漏斗中。加入40 mL乙醚萃取，重復(fù)3次，合并乙醚萃取液，用超純水洗滌至中性，過無水硫酸鈉除去殘留水分。萃取液于50℃水浴中減壓濃縮并回收乙醚，殘?jiān)蒙倭恳颐严粗? mL帶刻度試管中，氮?dú)獯蹈桑瑲埩粑镉?.00 mL無水乙醇復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)GC－MS分析。

1.2.3 定性和定量分析

植物甾醇的定性方法采用保留時(shí)間、標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)和質(zhì)譜庫檢索(NIST05a.L)方法;定量分析采用外標(biāo)法，依據(jù)總離子流圖峰面積計(jì)算每種植物甾醇的絕對(duì)含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測(cè)限

分別準(zhǔn)確稱取一定量上述4種植物甾醇標(biāo)準(zhǔn)品，加入無水乙醇溶解，10 mL棕色容量瓶定容，配制成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再逐級(jí)稀釋配制成系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。按照上述分析條件進(jìn)行檢測(cè)。以峰面積Y對(duì)植物甾醇濃度X進(jìn)行線性擬合，檢出限按S/N=3計(jì)算，結(jié)果見表1和圖2。可見，在本試驗(yàn)條件下，4種植物甾醇在選定的濃度范圍內(nèi)具有的線性關(guān)系(R≥0.999 2)，方法檢測(cè)限(分流進(jìn)樣)均在8.62 mg/L以下，采用不分流進(jìn)樣檢測(cè)限將更低。

表1 4種植物甾醇曲線方程及檢出限(濃度范圍20～500 mg/L)

圖2 4種植物甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 精密度和回收率

為檢驗(yàn)該方法對(duì)實(shí)際樣品的適應(yīng)性，采用標(biāo)準(zhǔn)品加入法。按上述方法測(cè)定，對(duì)選取的植物油樣品進(jìn)行了加標(biāo)回收試驗(yàn)，每種水平分別做7份平行試驗(yàn)，計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，4℃冰箱放置24 h后再測(cè)定，計(jì)算其日間變異系數(shù)，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)加入的回收率較高(89.4%～106.8%)，RSD小于5.50%，24 h內(nèi)測(cè)定結(jié)果無顯著變化。

表2 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果(n=7)

2.3 皂化條件的確定

試驗(yàn)在參考國(guó)內(nèi)外研究基礎(chǔ)上［13－15］，選用50%氫氧化鉀和無水乙醇混合液對(duì)樣品進(jìn)行皂化。試驗(yàn)選取花生油為代表，考察了不同的皂化溫度(65、70、75、80、85 ℃)、皂化時(shí)間(35、40、50、60 min)及皂化劑用量對(duì)花生油皂化程度的影響，結(jié)果表明:樣品在80℃水浴條件下，皂化40 min即可皂化完全，無水乙醇和50%氫氧化鉀溶液用量分別為30.00 mL和3.00 mL。

2.4 最佳色譜分離條件

J＆W DB－5MS UI毛細(xì)管色譜柱具有超高惰性，特別低的色譜柱流失，對(duì)難以分離的活性化合物有良好的峰形。研究選用J＆W DB－5MS UI毛細(xì)管GC柱，考察了進(jìn)樣口溫度、進(jìn)樣模式、分流比、初始溫度及升溫程序的影響，最終確定1.2.1所述分析條件，可在32 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)植物甾醇與其他不皂化物的分離，如圖3所示。可見，本研究建立的方法可實(shí)現(xiàn)待測(cè)組分和干擾組分的良好基線分離。

圖3 玉米油不皂化物總離子流圖

2.5 植物油樣品中甾醇的測(cè)定與分析

利用上述方法，對(duì)市售14種食用植物油中的4種植物甾醇進(jìn)行了分析，結(jié)果見表3。

由表3可知，植物油種類不同，其4種植物甾醇的含量、比例以及總量各不相同。大多數(shù)植物油中β－谷甾醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)居高，在47.5%～89.4%之間，其中，β－谷甾醇以橄欖油的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，達(dá)89.4%;其次為菜油甾醇，10.6%～54.5%之間，其中以菜籽油含量最高，占4種植物甾醇總量的54.5%，高于β－谷甾醇含量。同一種類不同品牌的植物油中4種植物甾醇比例基本接近，說明植物甾醇含量比例關(guān)系主要取決于原料，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致［11］;但總量存在一定的差異，可能與生產(chǎn)工藝、精煉方法、儲(chǔ)藏條件及原料品種等多種因素有關(guān)。

在純品植物油中，菜籽油和玉米油的4種植物甾醇總量最高，約5 000 mg/kg，其次是芝麻油;茶油和橄欖油的植物甾醇含量最低，這與該植物油不皂化物含量(≤1.5%)低有關(guān);除玉米油和菜籽油外，其余植物油中均未檢測(cè)到菜籽甾醇;茶油中的豆甾醇含量較高(26.9%～28.4%)，高于菜油甾醇，其余植物油中質(zhì)量分?jǐn)?shù)均小于15%;根據(jù)國(guó)際食品法典標(biāo)準(zhǔn)［16－17］對(duì)各種植物油甾醇總量和組成范圍規(guī)定，4種植物甾醇的含量及其總量基本在規(guī)定范圍內(nèi)，可見，采集的樣品真實(shí)性和可靠性強(qiáng)，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性高。

表3 植物油甾醇含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

5種調(diào)味油中姜油的甾醇含量最高，與玉米油和菜籽油含量接近，辣椒油和芥末油含量基本一致，由于原料同時(shí)含有植物甾醇，未能推測(cè)調(diào)味油中的植物甾醇來源于原料或者選用的植物油。

除上述4種植物甾醇外，同時(shí)檢測(cè)到少量其他植物甾醇(圖4，括號(hào)內(nèi)數(shù)值表示相似度)，主要包括麥角甾烷醇、羊毛甾醇、豆甾二烯醇、禾本甾醇、α－香樹脂醇、Δ7－豆甾烯醇、環(huán)阿屯醇。鑒定依據(jù)NIST05a.L質(zhì)譜庫檢索，以相似度 ＞85(最大值為100)確認(rèn)為該物質(zhì)。由圖可見，不同植物油其植物甾醇組成不同，由于試驗(yàn)條件限制，缺乏標(biāo)準(zhǔn)品，暫未能對(duì)上述7種植物甾醇進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析。

圖4 玉米油和葵花籽油總離子流圖片段

2.6 聚類分析

以4種植物甾醇絕對(duì)含量為變量、以平方歐氏距離為度量準(zhǔn)則、以組間連結(jié)法(between－group linkage)為組群合并準(zhǔn)則，用SPSS19.0軟件對(duì)14種25個(gè)植物油樣品進(jìn)行了系統(tǒng)聚類分析。結(jié)果見圖5。

圖5 植物油基于植物甾醇組成的聚類樹狀圖

圖5的分析結(jié)果表明:不同品牌的同一種植物油均可歸為同一類別，說明同種植物油的植物甾醇組成相似，與直觀的結(jié)果分析一致。經(jīng)過聚類分析后，橄欖油獨(dú)為一類，其植物甾醇組成與其他植物油之間存在明顯的差異;其余13種植物油可分為兩大類:其中菜籽油獨(dú)為一類，說明其與組內(nèi)其他樣本差異較大，葡萄籽油等12種23個(gè)植物油樣品為第二大類，說明組內(nèi)植物油的植物甾醇組成具有相似性。第二大類中茶油并未歸為任何亞類中，說明其與所在大類中其他樣本存在一定差異性，其余11種植物油又可分為兩大亞類，花生油、芝麻油、葵花籽油和葡萄籽油為第一亞類;玉米油等7種植物油為第二亞類。第一亞類又可細(xì)分為兩小類，8個(gè)品牌花生油為一類，說明花生油與第一亞類組內(nèi)的其他成員既有相似性又有所差別。姜油、大蒜油、芥末油、花椒油和辣椒油均為調(diào)和油，其植物甾醇組成與花生油、芝麻油等純品植物油存在差異，故劃分為同一類別，玉米油和大豆油經(jīng)聚類后與上述調(diào)和油劃分為同一大類，說明組內(nèi)成員之間有相似之處，分析其原因可能是調(diào)和油的配料組成不明確，選用的植物油可能是一種或多種。

3 結(jié)論

本研究建立了GC－MS測(cè)定食用植物油中植物甾醇含量的方法，并對(duì)常見14種食用植物油中的4種植物甾醇進(jìn)行了分析，方法準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好、適用性強(qiáng)，通過保留時(shí)間和質(zhì)譜定性，可準(zhǔn)確地測(cè)定植物甾醇的含量。通過系統(tǒng)聚類和直觀分析，初步認(rèn)為不同品牌的同種植物油的4種植物甾醇比例具有一致性，為食用油的品質(zhì)鑒定和營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)提供了科學(xué)依據(jù)，同時(shí)為消費(fèi)者的膳食合理搭配提供了參考，人們可根據(jù)自身需要，選用合適的植物油來增加總植物甾醇或某種植物甾醇的攝入量，以達(dá)到預(yù)防疾病的作用。

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