酸誘導擁擠條件下肌紅蛋白及突變體去折疊過程

張玉姣 唐 乾 曹洪玉 鄭學仿,2,*

(1大連大學生命科學與技術學院,遼寧大連116622;2大連大學遼寧省生物有機化學重點實驗室,遼寧大連116622)

1 引言

長期以來,體外模擬反應大都是在稀溶液中進行,而真實的細胞內是高度擁擠的.細胞內含有大量的多糖、蛋白質、核酸等大分子物質,這些大分子以不同濃度存在于細胞內,細胞質內所有大分子的濃度估計高達80-200 g·L-1,1細胞容積的20%-30%都被大分子占用.最近,提出分子伴侶概念的Ellis教授2呼吁生物學家們在研究體系中一定要加入細胞內相應濃度的擁擠試劑以模擬細胞內大分子擁擠環境.Sasahara等3在低pH的擁擠條件下研究脫輔基肌紅蛋白構象變化,發現擁擠試劑可以促進去折疊的蛋白質折疊為更為緊致的結構,擁擠試劑的存在增強了蛋白質的穩定性.McPhie等4在擁擠條件下研究脫輔基肌紅蛋白的構象變化,發現大分子擁擠試劑濃度的增加能促進去折疊的脫輔基肌紅蛋白向熔球態轉變,且這種現象與溫度無關,但擁擠條件下全輔基肌紅蛋白的去折疊是什么過程?是否與脫輔基的肌紅蛋白一致?

另外,人們一直認為蛋白表面的氨基酸殘基暴露在溶劑中,對蛋白的穩定性影響甚微.但最近幾年研究成果對這一觀念提出了質疑,Hoffman及其團隊5已經發現肌紅蛋白三突變體(三個表面的酸性氨基酸Asp44,Asp60,Glu85突變為賴氨酸)顯著增強肌紅蛋白與細胞色素b5復合體的結合能力及復合體內部電子轉移.而且他們也發現馬心肌肌紅蛋白44位天冬氨酸突變為賴氨酸后,突變體肌紅蛋白與細胞色素b5之間的電子傳遞速率增強了一個級別,6我們課題組已經探討過肌紅蛋白及突變體(D44K,D60K)與各種配體的相互作用,如與表面活性劑7,8以及氧化劑9等,均已證明突變體在與這些配體的作用中有別于野生型蛋白.在擁擠條件下突變體蛋白的去折疊過程是否有別于野生型蛋白呢?因此,本文利用多種光譜學手段研究大分子擁擠條件下全輔基肌紅蛋白及突變體D60K去折疊過程,通過比較酸穩定性特點,研究不同環境以及表面氨基酸的改變對蛋白質性質的影響.本項研究可對蛋白質穩定性維持和蛋白質折疊病的研究提供可靠的理論基礎.

2 實驗部分

2.1 試劑與儀器

馬心肌紅蛋白樣品(美國Sigma公司)UV-Vis吸收光譜特征峰表明幾乎全部為高鐵肌紅蛋白,使用時用Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液(0.05 mol·L-1)配制成濃度為5.0×10-6mol·L-1的溶液(避光保存并盡快用于實驗),突變體Mb(D60K)樣品(通過質粒轉化后,微生物培養法獲得,純度達96%以上)濃度為5.0×10-6mol·L-1,Ficoll70及Dextran70購于上海生物工程公司,均為國產分析純.

V-560型UV-Vis分光光度計、FP-6500型熒光分光光度計、J-810型圓二色分光光度計(均購自日本Jasco公司);F-12型制冷和加熱循環器(德國Julabo公司).

2.2 實驗方法

2.2.1 突變體D60K的獲取

細胞培養:將含有Mb(D60K)的質粒轉化E.coli BL21感受態細胞,挑取陽性克隆,接種到添加100 mg·L-1的溶菌肉(LB)培養基中大量培養,接種量為1%;離心收集細胞于-18°C凍存備用.

提取:取出凍存的細胞在室溫溶解,加入溶菌酶,攪拌,冰浴2-4 h,再加入鏈霉素并攪拌至細胞提取液為稀溶液.反復清洗細胞碎片,離心收集紅色上清液(6000 r·min-1,30 min,4 °C).

純化:采用硫酸銨分步沉淀.第1步硫酸銨飽和度65%,2 h.第2步硫酸銨飽和度是95%,過夜.離心收集到的沉淀透析除鹽,濃縮.濃縮液經過離子交換柱DEAE-Sepharose(1.6 cm×20 cm,pH 7.4,含有1.0×10-3mol·L-1乙二胺四乙酸鈉(EDTA)的 Tris-HCl緩沖液).洗脫液再經過Sephadex G-75凝膠柱(1.6 cm×50 cm)純化.最后得到的純度達到96%的D60K肌紅蛋白,超濾濃縮后-80°C保存.

2.2.2 樣品前期處理

將Mb溶解在不同pH值(6.5,6.0,5.5,5.0,4.5,4.0,3.5,3.0)的 0.05 mol·L-1的磷酸鹽緩沖液(PBS)中,蛋白終濃度達到5.0×10-6mol·L-1,對照組分別添加Ficoll70與Dextran70,使其終濃度達到100 g·L-1,室溫放置1.5 h后進行光譜測定;Mb(D60K)處理同上.

2.2.3 UV-Vis吸收光譜

將已處理的Mb(WT)和Mb(D60K)樣品置于1 cm石英比色池中進行測定,測定條件為:狹縫寬度為2 nm,掃描波長范圍220-700 nm,掃描速率200 nm·min-1,響應時間中等.

2.2.4 同步熒光光譜

將已處理的Mb(WT)和Mb(D60K)樣品置于1 cm石英比色池中進行同步熒光光譜測定,測定條件為:激發狹縫和發射狹縫分別為3和5 nm,掃描速率為500 nm·min-1,響應時間為0.5 s,檢測器靈敏度為中等,控制溫度(25.00±0.01)°C.

2.2.5 CD光譜

將已處理的Mb(WT)和Mb(D60K)樣品置于1 mm石英比色池中進行圓二色譜測定,測定條件為:狹縫寬度為1 nm,掃描波長范圍為190-250 nm,掃描速率為50 nm·min-1,響應時間為2 s,累計次數為3次.

3 結果與討論

3.1 Mb(WT)UV-Vis吸收光譜

Mb(WT)的UV-Vis吸收光譜受血紅素周圍微環境的影響,天然狀態的Mb(WT)溶液在409 nm(Soret)帶、503 nm(Q帶)、630 nm(金屬電子配體轉移(LMCT)帶)處有特征吸收峰,這分別是血紅素的中心鐵原子與吡咯環的四個氮原子形成配位鍵,第五配位結合His-93殘基,第六配位結合一個水分子形成的6-cHs(六配位高自旋結構),aquometMb的特征吸收譜帶.10圖1A為稀溶液中酸誘導Mb(WT)去折疊過程的紫外-可見吸收光譜,在pH 6.5→pH 5.5,Soret帶吸光值逐漸增大,pH 5.5→pH 4.0,Soret帶的吸光值逐漸下降,當pH為4.0時Soret帶的吸光值迅速下降且藍移至370.5 nm處,該過程中503 nm處的Q帶與630 nm處的LMCT帶峰位置沒有發生改變,當pH為3.5時,503 nm處Q帶紅移到513 nm,630 nm處的LMCT帶紅移到644 nm處.Dextran70存在時,pH 6.5→pH 5.5的Soret帶變化過程與未加擁擠試劑時相同,但pH降到4.0時,Soret帶強度下降幅度較大但峰位置沒有改變.當pH降為3.5時,Soret帶由409 nm藍移至370.5 nm處,同時503 nm處的Q帶與630 nm處的LMCT帶分別紅移到512和638.5 nm處,543 nm處出現新的吸收峰.當pH降為3.0時638.5 nm處的吸收峰紅移到644 nm.Ficoll70存在時,pH 6.5→pH 3.5,Soret帶變化過程與Dextran70存在時相同,但630 nm處LMCT帶變化過程與Dextran70存在時不同,pH 3.5時630 nm處吸收峰位置沒有發生改變,pH為3.0時630 nm處的吸收峰紅移到644 nm.

pH 6.5→pH 5.5血紅素周圍疏水微環境發生變化,血紅素中的二價鐵與水相互作用被氧化成高價鐵,從而形成了高鐵肌紅蛋白,使得409 nm處吸收峰值增大.隨著pH值繼續降低,氨基酸基團質子化造成了血紅素結合位點的改變,并使蛋白質構象發生了巨大的改變,11表現為血紅素輔基脫離肽鏈導致409 nm處吸收峰藍移至370.5 nm處.503 nm處Q帶吸收峰紅移主要是由于氫離子進入血紅素疏水中心,由Gouterman的四軌道模型12和Q帶與配體供電子能力的關系可知,溶液供電子能力增加導致肌紅蛋白Q帶紅移.LMCT帶由630 nm紅移到644 nm,主要是由于氫離子進入血紅素活性中心,氫離子與肌紅蛋白相互作用增強使得Fe-His-93位的配位鍵斷裂,高鐵肌紅蛋白(metMb)在血紅素活性位點處形成五配位高自旋結構.13Dextran70存在時Soret帶藍移、Q帶與LMCT帶紅移時所處的pH值低于稀溶液,產生此現象的原因是由于Dextran70是無交聯的線性大分子,14在溶液中形成準隨機螺旋,存在很多可以容納分子的間隙空間,對Mb(WT)產生不同的排阻體積,降低了血紅素與肽鏈的解離速度,對Fe-His-93位配位鍵起到了一定的穩定作用,從而對吸收峰轉移過程起到了延遲作用.Ficoll70存在時630 nm處LMCT帶紅移過程遲于Dextran70存在的變性溶液,Ficoll70是高度交聯共聚體,產生的排阻體積明顯大于Dextran70,阻礙了氫離子進入血紅素活性中心,減弱了氫離子與肌紅蛋白相互作用,降低了Fe-His-93位的配位鍵斷裂所處的pH值.

圖1 擁擠條件下Mb(WT)在不同pH溶液中的紫外-可見吸收光譜Fig.1 UV-Vis absorbance spectra of Mb(WT)as a function of pH under macromolecular crowding conditions

3.2 Mb(WT)圓二色光譜

通過CD光譜可以靈敏地檢測反應引起的蛋白分子的二級結構變化.在蛋白質或多肽的規則二級結構中,肽鍵是高度有規律排列的,排列的方向決定了肽鍵能級躍遷的分裂情況,因此具有不同二級結構的蛋白質或多肽所產生的CD譜帶的位置、吸收的強弱都不相同.

我們用遠紫外區圓二色光譜技術檢測Mb(WT)的二級結構變化情況,并用楊氏方程算法15計算Mb(WT)中的α螺旋、β折疊等含量變化.208和222 nm處兩個負槽,反映的是α螺旋的光譜特性.16圖2為酸誘導Mb(WT)去折疊過程的圓二色光譜,稀溶液中pH 6.5→pH 4.5,Mb(WT)208和222 nm處的負槽強度下降但形狀和肩峰的位置沒有發生明顯的改變.蛋白質在此pH值范圍內沒有變性,整個蛋白分子結構仍以α螺旋為主,在pH 4.5時無擁擠試劑的Mb(WT)二級結構有較大改變,α螺旋含量下降13.9%,這主要是由于大量的氫離子作用于肌紅蛋白表面使蛋白伸展并暴露出疏水殘基干擾蛋白的螺旋結構,更多的β折疊及無規則卷曲可溶性暴露結構出現.隨著酸度的增強蛋白質表面的正電荷增強使得位于蛋白表面的親水性側鏈基團發生了明顯的變化,維系二級結構的氫鍵作用力被破壞,對酸敏感的二級結構(α-螺旋及伸展肽鏈)開始解離,17β折疊、無規則卷曲含量在增加,蛋白質的有序度在降低,無序度在增加.18與稀溶液相比,擁擠試劑Dextran70與Ficoll70存在的蛋白溶液的負槽強度減弱程度低很多,但其二級結構仍遭到破壞,在pH 4.5時α螺旋含量分別下降9.5%、4.5%,此時擁擠試劑形成了高度擁擠的狀態降低了氫離子的擴散系數,阻礙了氫離子的運動,減弱了氫離子與蛋白質之間的相互作用力,蛋白質的二級結構改變值明顯低于無擁擠試劑的蛋白質溶液,擁擠試劑的加入對肌紅蛋白二級結構起到了保護作用.pH降到4.0時稀溶液中蛋白在208和222 nm處兩個負槽的形狀與強度發生了明顯的改變,而Dextran70與Ficoll70存在的溶液基本沒有發生改變,pH降到3.5時擁擠試劑存在的蛋白溶液的負槽形狀與強度發生明顯改變,蛋白質二級結構遭到嚴重破壞,CD光譜檢測的蛋白質二級結構變化過程與紫外-可見光譜檢測的蛋白質空間構象的變化過程相一致.

圖2 擁擠條件下Mb(WT)在不同pH溶液的圓二色光譜Fig.2 CD spectra of Mb(WT)as a function of pH under macromolecular crowding conditions

3.3 Mb(WT)紫外數據歸一化處理

圖3為擁擠條件下Mb(WT)在不同pH溶液中409 nm處吸收值的變化圖譜,通過紫外光譜與CD光譜可以清楚地看到稀溶液與擁擠條件下Mb(WT)血紅素輔基以及肽鏈的變化情況,為了更精確地比較擁擠試劑加入前后蛋白去折疊過程的差異,依據文獻19計算出變性中點pH(pH1/2),計算結果顯示稀溶液中Mb(WT)酸變性中點pH1/2(Mb)=4.25,Dextran70存在時pH1/2(Mb)=3.78,Ficoll70存在時pH1/2(Mb)=3.76.由此可見,擁擠試劑加入后Mb(WT)酸變性中點pH明顯下降,Mb(WT)的耐酸性提高,擁擠試劑具有酸變性過程中穩定肌紅蛋白結構的作用.

圖3 擁擠條件下Mb(WT)在不同pH溶液中409 nm處歸一化吸收值的變化Fig.3 Normalized absorption values of Mb(WT)at 409 nm as a function of pH under macromolecular crowding conditions

3.4 Mb(WT)熒光相圖分析

熒光相圖法是根據內源熒光發射光譜特定部位的熒光強度作圖,進而直觀地獲得蛋白質去折疊結構變化信息的方法.20發射波長分別為λ1和λ2的熒光強度分別為I(λ1)和I(λ2).變量間存在以下三個關系式:21-23

式中a和b分別為I(λ1)對I(λ2)作圖所得直線的截距和斜率,I1(λ1)和 I2(λ1)分別為λ1條件下蛋白質結構發生變化時始態和終態的熒光強度,I1(λ2)和I2(λ2)則分別是發射波長為λ2條件下蛋白質結構發生變化時始態和終態的熒光強度.分別選取波長為320和365 nm處的熒光強度為研究對象.

若蛋白質去折疊過程符合“全或無模型”或“二態模型”,熒光相圖表現為一條直線;若符合“三態”或“多態”模型,熒光相圖分別表現為兩條或多條直線.24-26

圖4A為稀溶液中酸誘導Mb(WT)去折疊過程熒光相圖,該熒光相圖表現為一條直線,表明稀溶液中隨著酸度增強Mb(WT)發生去折疊且去折疊過程為“二態”模型.圖4B、圖4C為擁擠試劑加入后Mb(WT)去折疊過程熒光相圖,該熒光相圖仍舊為一條直線,擁擠試劑的加入沒有增加Mb(WT)去折疊過程的中間態,圖中各pH值所對應的熒光相圖結果與紫外光譜、CD光譜變化結果相一致.

通過光譜數據與實驗計算結果可以看出:擁擠試劑的加入對Mb(WT)的空間構象以及氨基酸的微環境起到了很好的保護作用,而突變體Mb(D60K)的酸變性過程又是怎樣呢?

3.5 Mb(D60K)UV-Vis吸收光譜

圖4 擁擠條件下Mb(WT)在不同pH溶液中的熒光相圖Fig.4 Fluorescence phase diagram of Mb(WT)as a function of pH under macromolecular crowding conditions

圖5A為稀溶液中酸誘導Mb(D60K)去折疊過程紫外-可見吸收光譜,肌紅蛋白60位Asp突變為Lys后其去折疊過程與野生型有一定的區別,D60K約在542、580 nm處有特征吸收峰,此處是還原型蛋白的特征吸收峰,pH 6.5→pH 4.5,Soret帶的變化過程與野生型相同,pH為4.0時Mb(D60K)409 nm處吸收峰藍移至387 nm處(Mb(WT)則藍移至370.5 nm)且503、542以及約580 nm處吸收峰消失,630 nm處吸收峰紅移到644 nm處,當pH為3.5時409 nm處最大吸收峰藍移至370.5 nm.上述現象產生的原因主要是隨著酸度增強,溶液的pH值小于賴氨酸的等電點時,Mb(WT)的Lys-60上―NH2全都變為―NH3+,蛋白表面整體偏正電荷,而溶液pH值大于天冬氨酸的等電點時,Asp-60上的―COOH全都變為―COO-,蛋白表面偏負電荷;Mb的60位Asp突變為Lys改變了蛋白質表面的電荷,弱化了蛋白質表面電荷受pH值的影響,蛋白質與氫離子之間的相互作用減弱,從而延遲了最大吸收峰移動.

圖5 擁擠條件下Mb(D60K)在不同pH溶液中的UV-Vis吸收光譜Fig.5 UV-Vis absorbance spectra of Mb(D60K)as a function of pH under macromolecular crowding conditions

圖6 擁擠條件下Mb(D60K)在不同pH溶液的圓二色光譜Fig.6 CD spectra of Mb(D60K)as a function of pH under macromolecular crowding conditions

Dextran70存在時,pH 6.5→pH 4.5,各吸收峰變化過程與稀溶液相同,pH為4.0時,409 nm處最大吸收峰強度稍有下降但位置沒有發生改變,542、580 nm處吸收峰消失但503 nm處Q帶吸收峰與630 nm處的電子轉移帶沒有發生改變(稀溶液中409 nm處最大吸收峰藍移至387 nm)且503、542 nm以及580 nm處吸收峰消失,630 nm處吸收峰紅移到644 nm處.當pH降為3.5時,最大吸收峰藍移至373.5 nm處且503 nm處的吸收峰消失,藍移程度都明顯低于無擁擠試劑存在的Mb(D60K)溶液,pH降為3.0時最大吸收峰藍移至370.5 nm,此時蛋白質已變性,血紅素輔基完全脫離肽鏈.擁擠試劑Dextran70形成高度擁擠的環境降低了氫離子的擴散系數,減弱了氫離子與蛋白質的相互作用,從而延遲了蛋白質的變性過程.

Ficoll70存在時,pH 6.5→pH 3.5各吸收峰強度及峰位置基本沒有變化,當pH降到3.0時,409 nm處吸收峰強度迅速下降且藍移至370.5 nm處,503 nm處Q帶吸收峰以及約542、580 nm處吸收峰消失,但630 nm處的LMCT帶未發生改變,中間沒有經歷任何中間態,說明擁擠試劑Ficoll70的加入增強了突變體Mb(D60K)的酸穩定性且擁擠試劑Ficoll70對Mb(D60K)的穩定效果明顯強于Dextran70.

3.6 Mb(D60K)圓二色光譜

圖6為擁擠條件下Mb(D60K)在不同pH溶液的圓二色光譜,稀溶液中pH 6.5→pH 4.5,D60K酸變性過程與Mb(WT)相同,但pH 4.5時α螺旋含量下降6.2%,改變值明顯低于Mb(WT);擁擠試劑Dextran70存在時pH 6.5→pH 4.0,208和222 nm處的負槽強度基本沒有變化,但在pH 4.0時其α螺旋含量下降5.8%;Ficoll70存在時pH 6.5→pH 3.5,208和222 nm處的負槽強度基本沒有變化,只有在pH 3.0時負槽強度發生明顯變化,此時α螺旋含量下降7.4%.表面氨基酸突變與擁擠試劑的加入均增強了Mb(D60K)二級結構穩定性.

圖7 擁擠條件下Mb(D60K)在不同pH溶液中409 nm處吸收值的變化Fig.7 Normalized absorption value of Mb(D60K)at 409 nm as a function of pH under macromolecular crowding conditions

3.7 Mb(D60K)紫外數據歸一化處理

圖7為擁擠條件下Mb(D60K)在不同pH溶液中409 nm處吸收值的變化圖譜,通過譜圖數據計算D60K變性的中點pH,稀溶液中pH1/2(D60K)=4.19,Dextran70存在時pH1/2(D60K)=3.74,Ficoll70存在時pH1/2(D60K)=3.12.從上述數據可以看出肌紅蛋白第60位天冬氨酸突變為賴氨酸后酸變性中點降低,Dextran70存在時Mb(D60K)的變性中點pH值降低10.74%,Ficoll70存在時變性中點pH值降低了25.72%,擁擠試劑具有降低蛋白質酸變性中點的作用.

圖8 擁擠條件下Mb(D60K)在不同pH溶液的熒光相圖Fig.8 Fluorescence phase diagram of Mb(D60K)as a function of pH under macromolecular crowding conditions

3.8 酸誘導Mb(D60K)去折疊過程熒光相圖分析

圖8為擁擠條件下Mb(D60K)在不同pH溶液的熒光相圖,從圖中可以看出添加了擁擠試劑后Mb(D60K)去折疊過程仍為二態過程,擁擠試劑的加入并未增加Mb(D60K)去折疊中間態,擁擠試劑對Mb(D60K)的去折疊中間態沒有影響.

4 結論

本文通過加入大分子擁擠試劑,模擬高度擁擠的細胞內環境,研究酸誘導Mb(WT)及其突變體Mb(D60K)去折疊過程,結果顯示肌紅蛋白表面60位天冬氨酸突變為賴氨酸后增強了肌紅蛋白結構穩定性;大分子擁擠試劑加入后Mb(WT)及其突變體的去折疊過程明顯不同于稀溶液,擁擠試劑提高了Mb(WT)及Mb(D60K)的酸變性中點且Ficoll70對Mb(D60K)耐酸性的提高效果尤為顯著.肌紅蛋白表面氨基酸突變以及擁擠試劑的添加起到了穩定血紅素微環境、芳香族氨基酸、蛋白質二級結構和保護蛋白天然狀態的作用,為以后擁擠條件下蛋白質去折疊過程的研究提供參考依據.

Supporting Information: The original data of fluorescence emission spectrum are used to calculate the fluorescence phase diagram of Mb(WT)induced by acid.This information is available free of charge via the internet at http://www.whxb.pku.edu.cn.

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