芳基磺酰胺類丙酮酸激酶M2激動劑的基于多復合物的藥效團模型和定量構效關系

陳正軍 蔣慶琳 何 谷 韓 波 郭 麗

(1四川大學華西藥學院,成都610041;2成都醫學院藥學系,成都610500;3四川大學華西醫院,生物治療國家重點實驗室,成都610041;4成都中醫藥大學藥學院,成都611137)

1 引言

腫瘤細胞的能量主要來自糖酵解,腫瘤細胞的細胞能量代謝特性對于腫瘤的進展起著關鍵作用,1-4德國科學家Otto Warburg早在上世紀20年代就提出了著名的瓦伯格效應:腫瘤細胞比正常細胞需要更多的能量和核酸維持其生長增殖,而能量代謝不但為腫瘤細胞的生長提供能量,而且為腫瘤細胞增殖所需核酸的合成提供原材料,即使在有氧情況下,腫瘤細胞仍偏好于糖酵解方式進行葡萄糖代謝,而不采用能產生更多ATP的線粒體氧化磷酸化方式進行能量代謝.5,6隨著近年來氟化去氧葡萄糖正電子攝影斷層掃描(FDG-PET)技術的廣泛應用,組織標本的葡萄糖攝取量可檢測并成像,瓦伯格效應在越來越多的腫瘤類型中得以證實,探索通過阻斷糖酵解途徑而抑制癌細胞中能量的生成從而治療惡性腫瘤的策略受到越來越多的關注.7-9

糖酵解途徑是依賴細胞膜上的葡萄糖轉運體將胞外的葡萄糖轉運進胞內,通過己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)、乳酸脫氫酶(LDH)、磷酸果糖激酶(PFK)和磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)等糖酵解酶分解代謝,生成終產物丙酮酸.10研究表明這些糖酵解酶在惡性腫瘤中高表達,它們均有可能成為通過糖酵解途徑靶向治療惡性腫瘤的靶點.11丙酮酸激酶(PK)是糖酵解途徑中最重要的限速酶之一,在哺乳動物中,有2種不同的基因及產物,人體的大部分組織表達為丙酮酸激酶M(PKM)中的2種亞型PKM1或PKM2,所有的腫瘤細胞都表達PKM2,而分化組織多表達PKM1.12PKM2在低活性態和高活性態之間存在平衡,PKM2的活性形式主要以四聚體存在.據文獻13報道,在腫瘤細胞中,PKM2主要以低活性形式存在,與此相反,PKM1在其原生狀態具有較高的活性.在功能上,腫瘤細胞中PKM2的活性下調被認為有助于調節關鍵糖酵解途徑的朝向,有利于腫瘤細胞利用糖酵解途徑的中間產物作為其合成脂質、氨基酸、核酸等的前體.14綜上所述,激活PKM2的治療策略可能會將腫瘤細胞糾正為正常的細胞代謝水平,并恢復正常分化細胞的狀態特性.研究者們基于該思路已經設計和合成了多種PKM2激動劑,如雙磺酰胺類、磺酰吲哚類、噻吩并吡咯并吡嗪酮類等,這些小分子藥物中研發進度最快的已經完成了II期臨床試驗.15-19隨著PKM2多聚體晶體結構的闡明,尤其是雙磺酰胺類、磺酰吲哚類和噻吩并吡咯并吡嗪酮類激動劑與PKM2四聚體復合物的晶體結構被解析出來,以及計算機輔助藥物設計方法的應用,為基于靶點結構的PKM2激動劑設計和研發提供了可能.

近年來,文獻20,21報道了小分子PKM2抑制劑的合成和活性研究,在體外和體內抗腫瘤試驗中均表現出了良好的藥效.但小分子化合物和PKM2的定量構效關系(QSAR)研究尚未見文獻報道.本文采用基于多復合物的藥效團模型探討了芳基磺酰胺類化合物與PKM2的相互作用模式,并利用CoMFA和CoMSIA方法對一組芳基磺酰胺類衍生物類PKM2激動劑進行3D-QSAR研究,22,23討論了其三維靜電場、立體場空間結構與抗腫瘤活性之間的關系,以期得到較好的QSAR模型;分析了結構與活性的關系,本文的研究結果將為進一步設計、合成新型的PKM2激動劑提供理論基礎.

2 實驗部分

2.1 化合物的選擇

選取結構上具有相同骨架的62個具有類似骨架的芳基磺酰胺類PKM2激動劑為研究對象,20,21其結構如表1所示,它們均由同一個研究小組合成并測定活性的,這些化合物對PKM2的激動活性數據測定條件、方法相同,數據具有可比性.它們的生物活性指標用半數激動常數AC50的負對數,即pAC50進行量度,化合物的活性值列于表l.在具體計算時,隨機選取13個化合物(表中帶*號的化合物)作為測試集來評價模型的預測能力,其余49個化合物作為訓練集產生3D-QSAR模型.本研究所有工作都是在Sybyl-X 2.0軟件上完成的,計算中如未經特別指明,各參數均為Sybyl默認值.24

2.2 建立基于多復合物的藥效團模型

用于生成藥效團模型的6個PKM2-激動劑復合物晶體結構從蛋白質結構數據庫(PDB)獲得,25各復合物的詳細信息見表2.首先將所有晶體結構使用Discovery Studio(DS)軟件的“Multiple Structure Alignment”模塊疊合到一起,26疊合方式為蛋白質主鏈的α碳原子疊合,其他選項均為默認設置.使用Discovery Studio軟件的“Receptor-Ligand Pharmacophore Generation”模塊對每個疊合后的復合物分別生成藥效團,所有的藥效團特征與PKM2蛋白結構疊合見圖1,表2統計分析了所有的藥效團特征,具有代表性的共同藥效團模型如圖2所示.

2.3 活性構象確定及分子疊合

表1 PKM2激動劑的結構與活性Table 1 Structures and activities of PKM2 activators

continued Table 1

在CoMFA和CoMSIA計算中的關鍵步驟之一是確定所研究分子的活性構象,并對這些活性構象進行合理的疊合,疊合結果的好壞將直接影響最終模型的好壞,是CoMFA和CoMSIA計算能否成功的前提條件.27本文利用基于多復合物生成的共同藥效團模型產生的分子構象作為其活性構象,采用基于藥效團特征的疊合方式,以化合物中活性最高的分子53為模板,Discovery Studio軟件的“Ligand Pharmacophore Mapping”模塊將其余訓練集化合物與模板分子進行骨架疊合.

2.4CoMFA模型的建立

CoMFA分析在Sybyl-X 2.0軟件包的QSAR模塊中進行.分析力場包括靜電場和立體場,本實驗考察步長(0.05-0.2 nm)以及靜電場能和立體場能的截斷值(energy cutoff:4.187-502.4 kJ·mol-1)對CoMFA結果的影響.以sp3雜化的C+為探針,采用偏最小二乘法(PLS)對分子周圍分布的勢場值和生物活性進行回歸分析.28-30實驗中先用留一(LOO)法進行交叉驗證分析,來確定模型的交叉驗證相關系數(q2)和最佳主成分數(N).31然后再根據得到的最佳主成分數進行非交叉驗證來建立最終的比較分子場模型.

2.5 CoMSIA模型的建立

CoMSIA模型的建立方法與CoMFA類似,在建模的過程中,選取靜電場、立體場、疏水場、氫鍵受體場和給體場考察化合物與受體的相互作用,通過考察不同場的組合尋找具有最好交叉驗證系數的分子場.利用所得最佳場組合,進一步研究網格步長(0.05-0.2 nm)和衰減因子(0.2-0.4)對CoMSIA結果的影響.采用LOO法進行交叉驗證,得到對應的交叉驗證相關系數和最佳主成分數,隨后通過非交叉驗證進行回歸計算,從而建立相應的CoMSIA模型.

表2 PDB數據庫中6個PKM2-激動劑復合物的關鍵氨基酸殘基和藥效團特征分析Table 2 Analyses of critical amino acid residues and pharmacophore features for PKM2-activator complexes deposited in protein databank database

圖1 6個PKM2-激動劑復合物疊合示意圖Fig.1 Superimposition of six PKM2-activator complexes

2.6 模型驗證

QSAR模型采用LOO法進行內部驗證,通過未參與建模的測試集分子進行外部驗證.

3 結果與討論

3.1 基于多復合物的藥效團模型

用于生成藥效團模型的6個PKM2-激動劑復合物晶體結構詳細信息見表2.首先以分辨率最高的晶體結構3GR4為模版,將6個晶體結構疊合到一起,晶體結構疊合示意圖見圖1.由于PKM2與激動劑結合后以四聚體的形式存在,每2個亞基結合1個小分子激動劑,并且A/B亞基與C/D亞基完全對稱,為了清楚地顯示小分子與大分子間的相互作用,本文所有相互作用的結果均以A/B亞基為研究對象,并且經過比對,C/D亞基與小分子的結合方式以及小分子激動劑構象與A/B亞基完全相同.由圖1可見,所有6個PKM2蛋白的A/B亞基都很好地疊合到一起,并且所有的小分子激動劑都位于同一結合位點,說明這些小分子激動劑應該是以類似的方式與PKM2蛋白發生相互作用.所有基于復合物結構產生的藥效團特征見表2和圖2所示,按性質和與結合位點殘基的相互作用可分為11個藥效團特征,其中4個芳香環(Ar1-Ar4)、3個疏水相互作用位點(HP1-HP3)、2個氫鍵供體(D1,D3)和2個氫鍵受體(A1,A2).在這11個藥效團特征中,Ar1、Ar2和HP1這3個藥效團特征在大部分的復合物晶體結構中均有出現,說明其應該是小分子激動劑與PKM2具有共通性的相互作用;而其他藥效團特征僅在一兩個復合物中出現,說明其不具有普遍性,因此選擇Ar1、Ar2和HP1作為基于多復合物的共同藥效團進行下一步的研究.

圖2 PKM2-激動劑復合物產生的藥效團特征Fig.2 Pharmacophore features generated by the PKM2-activator complexes

根據文獻報道和課題組的前期研究結果,32-36基于多復合物的共同藥效團(MCBP)由于同時考慮了小分子與大分子的相互作用和小分子配體的化學結構特征,可能較單純基于小分子配體產生的藥效團更為全面;而與分子對接相比,MCBP同時考慮了多個復合物中大分子與小分子相互作用的共通特征,分子對接主要考慮的是單個大分子與小分子的相互作用;當應用于虛擬篩選時,MCBP有比分子對接更高的效率,當應用于產生3D-QSAR的活性構象和分子疊合時,基于MCBP的分子疊合的3DQSAR模型與基于分子對接的相當或略好.34為進一步驗證MCBP是否能有效地找到小分子化合物的活性構象,選擇與產生MCBP的6個復合物中小分子配體的化學結構類型不同的化合物1,使用Discovery Studio軟件的“Ligand Pharmacophore Mapping”模塊產生構象,擬合方式選擇‘flexible’,其他選項均為默認值,選擇產生出的小分子構象中與MCBP擬合度最高的與MCBP進行比較,結果如圖3所示,化合物1很好地再現了MCBP的藥效團特征,兩個芳香環分別位于Ar1和Ar2上面,而四氫喹啉環位于HP1附近,說明基于MCBP產生的小分子構象較好地反映了其與PKM2蛋白的作用方式,基于MCBP的小分子化合物構象疊合(見圖4)可以用于后續的3D-QSAR研究.

3.2CoMFA和CoMSIA模型

在CoMFA研究中發現,網格點步長選取0.1 nm,靜電場能和立體場能的energy cutoff值設為141.1 kJ·mol-1時得到CoMFA模型的結果最為理想.最佳CoMFA模型的統計學參數如表2所示,其中交叉驗證相關系數q2=0.545,最佳主成分數為4.一般認為,q2大于0.5時,所得模型具有可靠的預測能力.37由最佳主成分數進行非交叉驗證建立的CoMFA模型的非交叉驗證相關系數r2=0.966,標準偏差(SEE)為0.146,立體場和靜電場的貢獻值分別為47.8%和52.2%,表明基團的空間效應和電性分布對活性均有一定影響,靜電場的影響高于立體場.

圖3 基于多復合物的PKM2激動劑共同藥效團特征Fig.3 Multi-complex based common pharmacophore features of PKM2 activators

圖4 基于MCBP的分子構象疊合圖Fig.4 Molecular alignments based on the MCBP

對于CoMSIA模型,選取靜電場、立體場、疏水場、氫鍵受體場和氫鍵給體場5種場的不同組合來考察化合物與受體的相互作用,發現靜電場、立體場和疏水場組合所得結果最佳,當網格點步長為0.1 nm時所得結果最為理想.在CoMSIA計算中,采用高斯函數計算分子的相似性指數,函數中的α為衰減因子,其取值對計算結果有一定影響,最佳值一般在0.2-0.4之間.衰減因子在0.2-0.4范圍內CoMSIA模型均得到了理想的統計結果,當衰減因子為0.3時,得到最佳的CoMSIA模型.其統計學參數見表3.

3.3 3D-QSAR模型的驗證

為驗證所得到的CoMFA及CoMSIA模型的穩定性和預測能力,對訓練集中的49個化合物進行活性預測,并將未參加構建模型的測試集的13個結構類化合物放入已建立的3D-QSAR模型中,得到測試集化合物及訓練集化合物活性的預測值.CoMFA及CoMSIA模型對62個化合物抑制活性實驗值與預測值均列在表1中.將預測值與實驗值進行線性擬合,如圖5所示.其中測試集分子的實驗活性值和CoMFA、CoMSIA預測值之間的相關系數分別為0.966和0.987.從圖5可以看出,所有訓練集化合物的預測活性和實驗活性數據線性關系比較理想,表明由訓練集所得的CoMFA、CoMSIA模型都具有較好的相關性.測試集的13個分子的預測值和實驗值也都集中在直線附近,實測值與預測值之間的殘差不大,這也進一步證明此模型具有較好的預測能力,可以用于預測與骨架結構相似化合物的生物活性.

3.4 三維等值線圖

圖6是CoMFA立體場和靜電場的三維等值線圖.黃色區域表示相應位置減小基團的體積有利于提高活性,綠色區域表示此處增加基團的體積有利于提高活性;藍色區域表示增加化合物的正電性將有利于化合物活性的提高,紅色區域表示增加化合物的負電性有利于化合物活性的提高.圖中加入的化合物為模板分子53.

表3 最佳CoMFA和CoMSIA模型統計參數Table 3 Statistical parameters of the best CoMFAand CoMSIAmodels

圖5 實驗測定的pAC50值與CoMFA和CoMSIA預測的pAC50值的比較Fig.5 Comparison of experimental and predicted pAC50for CoMFAand CoMSIA

由圖6a可見,在化合物53的R1的右方位置有一塊綠色區域,左方有三塊較小的黃色區域,說明此處若取代基向右方適當增大體積可以提高化合物的活性,而向其他方向伸展則會降低活性.例如化合物48、53-55,當R1位置為1-羥基-異丙胺基時,化合物的活性相對較高,而當R1位置為其他體積較小基團,例如甲胺基或二甲氨基等取代時,化合物的活性則有不同程度的下降.圖中的化合物53的磺酰胺基和R2、R3取代基附近有較大的黃色區域,說明此處不宜有較大的取代基.由圖6b可見,在R1所在位右側有一塊藍色區域,說明在此處若連接有吸電子基團時,可以降低電子云密度,將有利于提高活性,例如化合物38-62在R1位置上連有鹵素或含氮基團,其活性普遍要比無取代基的化合物活性高;從圖中還可看出,在四氫喹啉取代基的2位有一塊紅色區域,說明此處若含帶負電基團可增加化合物活性;在R2取代基所在位置附近有一塊紅色區域,故R2取代基帶有吸電子基團可以增加化合物的活性.模型中立體場的貢獻(47.8%)與靜電場的貢獻(52.2%)相當,所以對化合物的修飾改造應均衡考慮空間位阻和靜電效應的要求.

圖7為CoMSIA模型的立體場、靜電場、疏水場和氫鍵受體場等值線圖.在圖7a中,綠色區域表示引入大體積取代基將有利于化合物活性的提高,黃色區域表示引入大體積取代基將有可能降低化合物的活性.圖7b的藍色區域表示增加化合物的正電性將有利于化合物活性的提高,紅色區域表示增加化合物的負電性有利于化合物活性的提高.CoMSIA模型的立體場和靜電場分布趨勢均主要在R1取代基所在位置,表明R1取代基應控制好取代基的伸展方向,并且帶負電的吸電子取代基應處于末端位置.在疏水場等值線圖中,黃色區域表示增加疏水性有利于提高活性,白色區域表示減少疏水性有利于化合物活性的提高,如圖7c所示,在R1、R2和R3所在位置均有黃色區域,表明在這些位置提高取代基疏水性有利于增加活性.

3.5 基于3D-QSAR的分子設計

圖6 CoMFA模型三維等值線圖Fig.6 Three dimensional(3D)contour plots of the CoMFAmodel

圖7 CoMSIA模型的三維等值線圖Fig.7 3D contour plot of the CoMSIAmodel

表4 設計化合物的預測活性Table 4 Predicted activities of designed compounds

圖8 設計化合物的結構Fig.8 Structures of designed compounds

QSAR研究的目的是根據模型設計新化合物并運用該模型預測新化合物的活性,為先導化合物的設計合成提供理論依據.38根據前面已建立的3DQSAR模型及有關分析結果,現以表1中生物活性較高的化合物為起始化合物,結合藥效團模型和課題組的研究基礎,嘗試對其分子結構進行修飾,新設計的化合物結構如圖8所示,用建立的3D-QSAR模型進行活性預測,得到的CoMFA、CoMSIA預測值見表4.利用R3的苯環或咪唑環以及四氫喹啉環滿足藥效團模型的要求,同時四氫喹啉環的3,4位用一個四氫呋喃環控制空間取向,同時也規避了大部分相關專利的保護;R4取代基引入二甲氨基或嗎啉環以滿足此處空間位阻和靜電需求,同時可以增加整個分子的水溶性;該系列化合物的生物活性有待進一步實驗的驗證.

4 結論

綜合采用基于多復合物的藥效團模型、CoMFA和CoMSIA方法建立了3D-QSAR模型,交叉驗證的相關系數分別為0.545和0.653,表明該模型具有良好的預測能力,其三維等值線圖直觀地解釋了化合物的定量構效關系,從立體場、靜電場和疏水場等方面全面地揭示了影響化合物活性的分子結構特征.對于設計新結構的PKM2激動劑來說,在保證化合物合適的空間結構取向以滿足藥效團模型的基礎上,在四氫喹啉環的2位宜引入帶吸電子能力基團;6,7位應注意控制基團的大小,避免引入較大基團;5,8位取代基則可適當增大基團的體積.這些結論為進一步結構優化、設計和合成新型的PKM2激動劑提供了理論依據.

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