泡沫分離法分離純化無患子皂苷的研究

林清霞，鄭德勇，2*

(1．福建農林大學材料工程學院，福建 福州 350002;2．福建農林大學茶葉科技與經濟研究所，福建 福州 350002)

植物中皂苷類物質常具有獨特的生物活性，近年來對人參［1］、絞股藍、百合［2－3］和文冠果［4］等原料中皂苷類物質進行了較深入的研究，開發出許多皂苷類藥物;從資源豐富的油茶籽［5］提取分離的皂苷已開始用于配制洗發香波等洗滌類產品［6］。無患子在我國淮河流域以南和廣東、福建、臺灣、廣西、云南等地［7］有廣泛分布，無患子假種皮中含有豐富的無患子皂苷，主要包括以常春藤皂苷元(hederagenin)為基本骨架的三萜類皂苷及一些倍半萜皂苷［8－9］，它們均具有很強的表面活性作用，是一類天然的非離子型表面活性劑［10］，Huang等［11］還發現從無患子果肉中分離的三萜皂苷具有抗癌等多種功效，近年研究還表明無患子皂苷對重金屬具有廣譜的洗脫作用［12］。

無患子皂苷的分離與純化是無患子皂苷資源的開發利用基礎，目前一般采用萃取法、膜分離法、大孔樹脂法等［13］。饒厚曾等［14］分別用正丁醇和乙醚萃取提純皂苷和皂苷元，但這一工藝溶劑量耗費較大，并且所得皂苷產率及純度不高;魏鳳玉等［15－16］采用水提－大孔樹脂吸附分離法及超濾法對無患子皂苷進行分離純化，總皂苷純度可分別達85%、67%，但仍存在著成本高、周期長等問題。泡沫分離法與上述分離方法相比無需使用大量有機溶劑，運行成本較低，在蛋白質分離［17］上的應用比較成熟，近年來在分離人參皂苷［18］、三七皂苷［19］等天然皂苷類中也取得了較好的成效。本研究嘗試將泡沫分離法應用于無患子皂苷的分離。

1 實驗

1．1 原料、試劑和儀器

無患子假種皮由福建省大青實業有限公司提供，經日曬、風干備用。試驗中除高效液相色譜分析所用甲醇為HPLC級之外，其余試劑均為分析純。

UV－2800AH紫外分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司;高效液相色譜(1200 series)，美國安捷倫公司。自制泡沫分離裝置:由泡沫分離柱、空氣泵、氣體分布器、轉子流量計(LZB－4，燕山儀表總廠)、恒溫循環器(HX－1050，北京博醫康實驗儀器有限公司)等組裝。其中泡沫分離柱為玻璃管制成，高600 mm，直徑40 mm。由分離柱底部通入空氣，分離柱外部有直徑60 mm夾套，可通入循環水，以控制分離溫度。

1．2 試驗原料液制備

無患子濃縮液:2 000 g無患子假種皮經清水洗滌、瀝干后，每次加入10 L 60% 乙醇，浸提3次，合并濾液，濃縮至3 L。加入9 L 95% 乙醇溶液進行醇沉，于陰涼處靜置過夜，濾去多糖等沉淀物。濾液于旋轉蒸發器上蒸發，回收乙醇，即得無患子濃縮液。經檢測，其含固形物為45．30%。

1．3 無患子總皂苷含量的測定

1．3．1 無患子總皂苷測定條件的優化 稱取自制的無患子皂苷標準品10 mg，用甲醇定容于10 mL容量瓶中，取100 μL該溶液于試管中，并置于水浴中揮干溶劑。分別加入顯色劑與氧化劑，待顯色完全后用紫外分光光度測定其吸光度。參照魏鳳玉等［20］選取顯色劑為香草醛、氧化劑為高氯酸。改變所加入的5%香草醛與高氯酸的比例及反應時間，將顯色樣品于400～800 nm范圍內進行紫外掃描，對比不同紫外光圖譜，獲得測定無患子皂苷的最佳條件為:分別加入0．4 mL 5% 的香草醛和1．2 mL高氯酸試劑，搖勻后置于70℃ 的水浴中加熱20 min，再冰浴3 min，最后加入5 mL冰醋酸搖勻，采用紫外分光光度計在481 nm波長下測定皂苷含量。

1．3．2 無患子總皂苷標準曲線的繪制 取12．4 mg無患子皂苷純品于10mL容量瓶中用甲醇定容。分別吸取該標準溶液50、100、200、300、400和500 μL于試管中，并置于水浴中揮干溶劑，采用上述優化方法測定紫外吸光度。

1．4 泡沫分離法純化無患子皂苷試驗

在一定的進料濃度、進料量、pH值和分離氣速、溫度的情況下，采用自制的泡沫分離裝置進行泡沫分離操作，收集塔頂溢出的泡沫，采用攪拌法消泡，用量筒測量泡沫液的體積，并測定其固形物、總皂苷。分離效果通過收率、富集比以及純度進行表征。計算公式如下:

式中:Y—總皂苷收率，%;Cf—泡沫液中總皂苷質量濃度，g/L;Vf—泡沫液體積，mL;Ci—進料液總皂苷質量濃度，g/L;Vi—進料量，mL。

式中:E—總皂苷富集比;Cf—泡沫液總皂苷質量濃度，g/L;Ci—進料液皂苷質量濃度，g/L。

式中:P—總皂苷純度，%;Cf—泡沫液總皂苷質量濃度，g/L;Vf—泡沫液體積，mL;Wf—收集液烘干后所得固體的質量，mg。

2 結果與分析

2．1 無患子總皂苷標準曲線

采用1．3節方法測定無患子總皂苷系列標準溶液的吸光度，以溶液中無患子總皂苷質量為自變量(X，mg)，以測試液吸光度(Y)為因變量，可得到無患子總皂苷含量與吸光度的標準曲線為Y=3．577X+0．01(R2=0．999 4)。

2．2 泡沫分離純化條件對分離效果的影響

2．2．1 進料量的影響 在進料濃度2．0 g/L、料液pH值4．3、氣速32 L/h、溫度40℃ 條件下，改變進料量(50、100、150、200和250 mL)進行泡沫分離操作，結果如圖1。

由圖1可知，收率隨著進料量的增加呈現上升趨勢，富集比隨著進料量的增加呈下降趨勢，而泡沫中皂苷的純度在這過程中變化不大。這是因為隨著進料量的增大，鼓泡區變大，相應的泡沫分離區就小了，泡沫中更多的夾帶液在回流前被收集，因此收率增大。另外，由于進料量的增加，液體回流時間減少，使得更多的泡沫夾帶液被收集，則富集比呈現下降的趨勢。綜合以上3個指標可見，當進料量在150 mL左右時，泡沫分離效果較好。

2．2．2 初始進料濃度的影響 在進料量150 mL、料液pH值4．3、氣速32 L/h、溫度40℃ 條件下，改變進料濃度(1．0、2．0、3．0、4．0 和5．0 g/L)進行泡沫分離操作，結果如圖2。

圖1 進料量對泡沫分離效果的影響Fig．1 The effect of the initial solution volume on foam separation

圖2 進料濃度對泡沫分離效果的影響Fig．2 The effect of the initial concentration of saponin on foam separation

由圖2可知，無患子總皂苷收率及富集比隨著進料濃度的增加都呈現下降趨勢，收率在初始濃度為3．0 g/L之前下降得比較緩慢，之后急速下降。而富集比在初始濃度為3．0 g/L之前下降得較快，之后趨于平衡。泡沫中皂苷的純度則隨進料濃度的增大呈緩慢下降趨勢。這是由于在進料濃度低時，泡沫較不穩定、易破裂，泡沫中夾帶液的量相對較少，因此富集比與純度都較高。收率隨著進料濃度的增大也是整體呈下降變化，可能是實驗中所用的鼓泡器的孔徑比較大，不利于高濃度溶液的分離并且由于實驗中的皂苷濃度超過臨界膠束濃度［10］(無患子皂苷在25℃ 時的臨界膠束濃度cmc為33 mg/L)，皂苷分子在氣液界面處無法通過吸附原理富集，使得夾帶液在泡沫液中增加的速度大于皂苷增加的速度，因此收率減小。綜合可知當進料量濃度在2．0 g/L左右時，泡沫分離效果較好。

2．2．3 氣速的影響 在進料量150 mL、濃度2．0 g/L、料液 pH 值4．3、溫度40℃ 條件下，改變分離氣速(16、24、32、40和48 L/h)進行泡沫分離操作，結果如圖3。

由圖3可知，皂苷收率隨著氣速的增大呈現上升趨勢，富集比和純度隨氣速增大呈下降趨勢。這是由于氣速較低時泡沫到達管頂端的時間延長、回流時間增加，即分離區變大了，使得泡沫液中的夾帶液減少，導致收率較低、富集比較高、純度較高。當氣速介于24～32 L/h時，收率增加得相對較快，此時富集比與純度都稍微增大。這可能是由于該過程泡沫夾帶液增加的速率小于皂苷增加的速率，因此富集比與純度反而增加了。綜合以上指標可得，當氣速介于24～32 L/h范圍內，有較好的分離效果。

2．2．4 溫度的影響 在進料量150 mL、濃度2．0 g/L、料液pH值4．3、氣速32 L/h條件下，改變分離溫度(5、10、20、30、40、50和60℃)進行泡沫分離操作，結果如圖4。

由圖4可知，無患子皂苷的富集比、收率以及純度都在30℃ 時達到最大。在30℃ 之前，三者都呈上升變化。在30℃ 之后，都大體呈下降變化。而在20～40℃ 范圍內變化得最為明顯。這是由于無患子皂苷在25～40℃［8］附近時表面活性穩定，過高或過低的溫度都不利于泡沫的穩定性，因此分離效果也會受影響。可見，維持溫度為30～40℃ 左右時，泡沫分離效果較好。

圖3 氣速對泡沫分離效果的影響Fig．3 The effect of the gas flow rate on foam separation

圖4 溫度對泡沫分離效果的影響Fig．4 The effect of the solution temperature on foam separation

2．2．5 pH 值的影響 在進料量150 mL、濃度 2．0 g/L、氣速 32 L/h、溫度 40 ℃ 條件下，改變 pH 值(3．5、4．3、6、7、8、9)進行泡沫分離操作，結果如圖5。

由圖5可知，在酸性條件下皂苷收率隨著pH值上升呈上升趨勢，當pH值超過6以后收率呈下降變化，即在酸性條件下皂苷的收率高于堿性條件。這是由于無患子是一種天然弱酸性表面活性劑，在酸性條件下所形成的泡沫更加穩定。皂苷的富集比在pH值為8以前整體變化不大，在pH值為8～9時富集出現大幅度變化，可能是堿性太強，泡沫破碎得比較快，因此夾帶液很少，加之分離管的管徑相對較小，破碎的泡沫更容易分出，使得富集比較高。但pH值對富集比和純度的影響均較小。綜合以上變化趨勢，考慮到無患子皂苷是一種弱酸性表面活性劑，因此pH值為4～6范圍內分離效果較好。

綜上所述，當進料濃度為2．0 g/L左右、進料量為150 mL左右、氣速在24～32 L/h之間、溫度范圍30～40℃、pH值為4～6時，無患子皂苷的泡沫分離效果較好。

2．3 重復性驗證試驗

在進料濃度2．0 g/L、進料量150 mL、氣速32 L/h、溫度30℃、pH值為4．3條件下，進行重復性驗證試驗，結果見表1。

圖5 pH值對泡沫分離效果的影響Fig．5 The effect of solution pH values on foam separation

表1 重復性驗證試驗的結果Table 1 The results of verification test

由表1可知，富集比、收率、純度的RSD分別為1．29%、1．36% 和2．24%，表明以上試驗的重現性良好。當進料濃度2．0 g/L、進料量150 mL、氣速32 L/h、溫度30℃、pH值4．3條件下，富集比可達到2．153，收率與純度分別達到79．19% 和74．68%。

3 結論

3．1 進料濃度、進料量、氣速、pH值和溫度等工藝因子對泡沫分離效果均有顯著影響。無患子皂苷的收率隨進料濃度的增大而降低，而隨氣速、進料量的增大而提高，且在酸性條件以及溫度為30～40℃范圍內收率較高。無患子皂苷的富集比隨進料濃度、氣速、進料量的增大而降低，且在溫度為30～40℃范圍內富集比較高，受pH值的影響相對較小。無患子皂苷的純度隨進料濃度、氣速的增大而降低，且在溫度為30～40℃ 范圍內純度較高，隨進料量及pH值的影響較小。

3．2 泡沫分離法可以較好地解決皂苷提取過程中純度低等問題，分離過程工藝穩定、分離效果好。在進料濃度2．0 g/L、進料量150 mL、氣速32 L/h、溫度30℃、pH 值4．3條件下，富集比可達到2．153，收率與純度分別達到79．19% 和74．68%。

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