淺談蜜環菌母種培養與轉擴改革

楊輝德

(黃岡職業技術學院生物化工學院，湖北 黃岡 438002)

天麻是名貴中藥材，現已由傳統醫用發展到飲食及滋補保健等行業，社會需求量急增，導致天麻種植的共生菌蜜環菌菌種生產量也與日俱增。但隨著對蜜環菌生長習性認識的逐步深入，筆者發現蜜環菌母種生產中存在的一些問題。一是蜜環菌母種在斜面培養生長不理想;二是蜜環菌在瓊脂培養基上極易產生褐化及角質化，使菌種發生退化;三是傳統從試管表面轉管與擴繁容易導致污染。上述問題均影響了制作蜜環菌母種的質量與轉擴成功率。通過對上述問題的試驗探索，在借鑒他人經驗的基礎上，進行大膽的探索與改革，很好地解決了上述問題，現總結如下。

1 蜜環菌母種的生產與轉擴中存在的問題

在多年培養蜜環菌母種實踐中，開始對蜜環菌不太了解，在培養基配制、試管分裝、母種轉管與擴繁中總按對待其它食用菌的辦法進行操作，并沒有考慮蜜環菌生長的個性要求。在實際生產中出現一些不盡人意的事情，如斜面培養菌種量過小、PDA培養基種性易退化、從試管表面接種易污染等問題。

1.1 試管斜面培養菌種量小

傳統上蜜環菌母種采用試管斜面培養，主要考慮增加菌種與氧氣的接觸面積，通常是18 mm×180 mm試管裝7 mL～8 mL，或20 mm×200 mm試管裝10 mL～12 mL，所裝高度只占試管1/5～1/4 之間。擺成斜面后高度占試管 1/2 ～3/5 之間，所裝液量較少，培養母種量有限。

1.2 PDA培養基種性易退化

蜜環菌母種制作，不管是菌種制作廠家還是天麻種植者，大多采用傳統的PDA、PDA加富或PDA+黃豆粉等培養基。這些傳統培養基有許多不足之處一是不能為蜜環菌提供充分的營養來源;二是由于蜜環菌是喜濕性菌類，在培養基上更易吸收游離態水，而傳統的瓊脂培養基以結合態水為主要存在形式，不能很好地為其提供所需水分，致使蜜環菌的生長受到一定抑制;三是在瓊脂培養基上，菌種容易產生褐化及角質化，這是蜜環菌退化的標志，因而影響了培養母種的質量，降低了天麻生產產量。

1.3 固體培養生長不理想

傳統的蜜環菌母種培養均采用瓊脂作凝固劑，這都源于對蜜環菌缺乏了解。蜜環菌是喜濕性菌類，更易于吸收游離態水，在瓊脂作凝固劑中以白色菌索形式出現，但分枝較少;而在原料為主的半固體培養基中也以白色菌索形式出現，但分枝較多，生長更旺。

1.4 從試管表面接種易污染

在后期生長中，蜜環菌母種在菌柱表面分泌色素形成老菌皮，上面還形成菌索伸向試管口。因而從試管表面接種增加了接種操作難度，同時隨著保藏時間的延長，母種菌柱上部會失水干縮并產生色素，這一部分菌種更容易出現退化問題;再者菌種在長期保藏中菌種表面可能有雜菌，致使從試管表面接種易污染，母種轉管與擴繁成功率不高。

2 蜜環菌母種生產與轉擴的改革方法

2.1改試管斜面為試管菌柱

由于蜜環菌母種能以菌索方式存在，菌索有輸送氧氣的能力。因此，蜜環菌母種培養可改用試管菌柱方式進行。試管菌柱制作減少了擺斜面的操作環節，菌柱高度與試管斜面同樣只占試管1/2～3/5之間，用18 mm×180 mm試管裝液量為18 mL～20 mL，20 mm×200 mm試管裝液量23 mL～25 mL，裝液量是試管斜面的2.5倍。試管菌柱培養的母種見圖1，從而在同樣的容器中提高了母種的生產數量，節約成本，提高效益。

2.2 改固體方式為半固體方式

使用玉米粉100 g、黃豆粉10 g、麥麩80 g、蔗糖 (白糖)20 g、水1 000 mL作培養蜜環菌母種的的配方。培養基的狀態呈半固體狀，具有流動性。先將稱量好的玉米粉、黃豆粉、麥麩用適量水調勻。再添足水煮制，待煮沸時開始記時，保持35 min即可，注意在加熱過程中需不時攪拌，以免煮糊。注意適量添水，以補充加熱過程中損失的水分。煮好后加入所需的蔗糖，趁熱采用注射筒或其他裝置分裝。分裝后塞好棉塞，將試管豎直放置。由于該培養基營養相當豐富，再加上玉米粉徹底滅菌相對較難。因此滅菌時間應比常規培養基稍長一點，一般將其控制在高壓條件下0.15 MPa下滅菌35 min～40 min。滅菌完成后，待冷卻至試管不燙手時將其取出，豎直放置，待完全冷卻后再開始接種操作。采用玉米粉等原料半固體方式培養的蜜環菌母種見圖2。

2.3 改PDA培養基為綜合培養基

用傳統的PDA、PDA加富、PDA+黃豆粉等培養基培養蜜環菌母種，菌種呈菌索狀，菌索生長粗狀，分枝也多，在菌柱表面分泌的色素多，易形成褐化及角質化。而用馬鈴薯100 g、木屑 50 g、麥麩 50 g、玉米粉 50 g、瓊脂 10 g、KH2PO42 g、MgSO41 g、VB110 mg、水1 000 mL的綜合配方培養蜜環菌母種，培養的母菌呈菌絲狀，菌絲分枝細密，生長勢強，日平均生長速度達5.18 mm·d－1。且經1年時間保藏失水不嚴重、耐貯藏，與PDA培養基配母種質量有顯著差異，在推廣中增產明顯。

2.4 改試管表面轉擴為試管底部破碎轉擴

鑒于蜜環菌母種從試管表面接種易污染的現實，筆者進行了多次改從試管底部破碎轉擴試驗，成功率高達98%。具體操作步驟如下:第一步挑選健壯的母種試管;第二步在試管下半部菌柱的部位用寬透明膠帶纏繞并用75%酒精消毒;第三步在超凈工作臺或接種箱中敲碎管底，無菌操作中一只手拿試管口棉塞處，另一只手用鑷子從試管底部破碎處挑取母菌進行轉擴接種。操作步驟與操作方法見圖3。

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