葛種質資源親緣關系的RAPD分析

周精華，揭雨成，2* ，杜曉華，邢虎成，2，熊力夫

(1湖南農業大學苧麻研究所，長沙410128;2湖南省種質資源創新與資源利用重點實驗室，長沙410128;3長沙市葛根工程技術研究中心，湖南長沙410005)

葛(Pueraria DC)又名葛藤、葛麻葉、甜葛藤、粉葛藤等，是豆科碟形花亞科菜豆族(Phaseolease)多年生纏繞藤本植物［1］。世界上有葛20余種，我國是葛屬植物的分布中心，大約有12種，其中可入藥的有8種。野葛是產量最高、使用最廣的品種，除西藏、青海、新疆外，其它省區均有分布，粉葛則主要產于廣西、廣東，以栽培為主［2，3］。葛根是我國醫療保健的良方妙藥，多部醫藥著作均有記載其性味功能和醫療保健作用，其主要藥用成分為黃酮類物質，是一種開發前景廣闊的藥用植物［4～6］。但是由于其產地、氣候和生態環境等因素的影響，不同葛種質資源中所含的有效成分差異較大，加上我國葛種質資源分布廣泛，種質資源之間的親緣關系不清楚，給葛的研究開發和利用帶來很大困難［7］。采用RAPD分子標記研究葛種質資源之間的遺傳多樣性和親緣關系，對葛種質資源的遺傳育種、研究開發和利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑和材料

基因組提取試劑盒購自TIANGEN，Premix Taq Version2.0(Loading dye mix)購自 TaKaRa公司，GeneRuler 1 kb DNA Ladder購自Fermentas公司;其余試劑均為國產分析純或化學純。8份葛材料來自湖南和江西等地，由于采樣關系，沒有記錄相應的表型數據。葛樣品的編號和名稱見表1。

表1 8份葛材料的名稱及來源Table 1 The name and origins of 8 arrowroots

1.2 試驗方法

采用TIANGEN的基因組提取試劑盒提取葛的葉片的基因組DNA。提取的DNA用0.8%的瓊脂糖電泳檢測DNA的質量和濃度，用無菌水將DNA稀釋至20 ng/μL，－20℃保存備用。

1.3 PCR擴增和檢測

參考已有文獻中的 RAPD 反應體系［8～11］，對RAPD的影響因素如引物濃度、模板DNA濃度、退火溫度等進行梯度試驗，獲得最適RAPD反應條件。RAPD擴增反應體系采用20 μL的反應體系，其中包含20 ng的 DNA 1 μL，20 mmol/L 的引物1 μL，2×Premix Taq Version2.0(dNTP each 0.4 mmol/L，Mg2+0.3 mmol/L，TaKaRa Taq 0.5 U)10 μL 和ddH2O 8 μL。PCR反應程序為:94℃預變性5 min;94℃ 30 s，37℃ 30 s，72℃ 90 s，40 個循環;最后72℃延伸7 min，取8 μL PCR產物于含EB的1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測;電泳緩沖液為1×TBE，在100 V電壓下電泳50 min后用柯達凝膠成像系統照相。

1.4 引物篩選

選用生工生物工程(上海)股份有限公司提供的100條隨機引物，隨機抽取3個樣品對100條隨機引物進行篩選;選出擴增條帶數量多、條帶清晰、多態性穩定的隨機引物10條用于全部葛種質資源的擴增和RAPD分析。

1.5 數據統計和分析

根據PCR擴增產物電泳結果進行統計分析，擴增產物在相同遷移位置有條帶賦值為1，無條帶賦值為0，建立原始數據矩陣。采用NTSYS－PC 2.1統計分析軟件中的UPGMA法進行聚類分析，得到遺傳相似系數，并根據遺傳相似系數建立聚類分析圖。

2 結果與分析

2.1 RAPD標記的多態性分析

采用100個隨機引物對隨機抽取的3份葛種質資源DNA進行PCR擴增，篩選出具有多態性且擴增條帶清晰的隨機引物10條。10條多態性較好的引物對8份葛材料的PCR擴增結果顯示，擴增產物在200～3 000 bp，共擴增出99條帶，其中多態性條帶65條，多態性程度為65.65%。其中引物S82和S172的多態性位點較多，分別為83.33%和88.88%(圖1和表2)。

圖1 S82和S172引物的RAPD擴增Fig.1 Amplification of RAPD with S82 and S172 primers

表2 RAPD引物及擴增結果Table 2 The sequences and amplification results of RAPD primers

(續表2)

2.2 遺傳相似系數分析

利用NTSYS－PC 2.1統計分析軟件對RAPD擴增所得多態性位點進行統計分析，發現8份葛材料的遺傳相似系數在0.626～0.939之間(表3)，其中E3與其他材料的遺傳相似性在0.626～0.767之間，說明E3與其他材料的親緣關系最遠;E7和E8的遺傳相似系數為0.939，即兩者之間的親緣關系最近。

表3 8份葛材料的遺傳相似系數Table 3 Genetic similarity coefficient of 8 arrowroot varieties

2.3 聚類分析

采用UPGMA法構建葛種質資源的遺傳關系聚類圖(圖2)，在遺傳系數為0.740時，可將8份葛材料分為4類，第1類只含1份材料E3，來源于湖南漢壽的選育品種，農藝性狀較好，和其他材料親緣關系較遠，可以進行雜交育種，具有很大的利用價值;第2類也只含有1份材料E6，是湖南桃江的一個栽培品種;第3類包含2份材料E4和E5，均來自江西;第4類包括4個品種 E1、E2、E7和E8，其中 E1和E2是湖南漢壽選出的兩個重要栽培品種，農藝性狀和品質性狀均較好，E7和E8是來自湖南桃江的2個野生材料，親緣關系較近。從聚類結果看，葛材料所屬類群與地理來源有關。

圖2 8份葛材料聚類分析圖Fig.2 The clustering analysis of 8 arrowroot varieties

3 討論

RAPD分子標記具有數量多，顯性或者共顯性、簡單易行、無需明確知道基因的序列等特點［12］，被廣泛應用于各種植物的遺傳多樣性分析和品種鑒別等方面［13，14］。但是由于RAPD－PCR影響的因素太多，重復性和穩定性較差，如模板的濃度太高會增加非特異性條帶的擴增，而模板濃度太低又會影響PCR的擴增，甚至使PCR擴增失敗;退火溫度影響引物與模板之間的結合，退火溫度過高，引物與模板結合的位點變少，使擴增條帶減少，退火溫度過低，易導致非特異性擴增，甚至產生拖尾現象，影響讀帶等等;還有Mg2+濃度、dNTP濃度、Taq的量等也影響 RAPD 的 結 果［9，11，15～18］。因 此，往 往 需 要 對RAPD的條件進行優化，本研究優化了RAPD－PCR的退火溫度、模板濃度和引物濃度，發現退火溫度為37℃，模板濃度為20 ng，引物的終濃度為1 mmol/L時，擴增的條帶最多，條帶最清晰。

從DNA分子水平來說，遺傳距離的變幅越大，說明其遺傳分化越大，遺傳多樣性高，表明遺傳背景復雜及該物種存在歷史長遠。景戌等人對重慶地區葛遺傳多樣性進行RAPD分析表明，12個隨機引物共檢測出109條帶，其中多態性位點占64.41%，36份葛種質資源的遺傳距離在0.000～0.360之間，葛種質資源遺傳相似系數按類平均法，可聚為3類［19］。本研究中10個多態性較好的隨機引物共檢測出99條帶，多態性位點占65.65%，與景戌等人研究的多態性比例接近。本研究中的8份葛材料的遺傳相似系數最大的為0.939，最小為0.626，表明葛在遺傳進化過程中，隨著時間和空間的變化，其基因組發生了很大的變化，從而構成了豐富的葛種質資源庫，這為葛遺傳育種和品種改良提供了良好的基礎。

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