酵母雙雜交表達載體pGBKT7_NPR1與pGADT7_NPR1的構建及酵母菌的轉化

肖 牧，徐 健，何 樂，劉春林，阮 穎*

(1湖南農業大學生物科學技術學院，長沙410128;2湖南農業大學作物種質創新和資源利用國家重點實驗室培育基地，長沙410128)

擬南芥NPR1是水楊酸(Salicylic acid)介導的系統獲得性抗性(systemic acquired resistance，SAR)途徑中不可或缺的一個轉錄輔助因子，其包含的BTB/POZ結構域［1］以及錨蛋白重復序列是行使其生物學功能的基礎［2］。在SA誘導下，NPR1被轉入到細胞核內并與一些轉錄因子結合，啟動下游基因的表達。它介導植物對一系列水楊酸途徑應答的植物病原菌，如 Pseudomonas syringae和 Peronospora parasitica的抗性。擬南芥中，過量表達NPR1能夠增加植物對水楊酸或者功能類似物，如MeSA、BTH的敏感性，但并不會導致植物的形態改變，在未受到誘導物或者病原菌刺激的情況下，病原相關基因PRs(pathogenesis－related gene)的表達水平亦不會出現明顯上升。而在受到刺激后則表現出更強的PR1基因誘導以及對病原菌的抗性［2］。NPR1缺失突變背景下，擬南芥表現出對各種SAR誘導物不敏感、喪失PR基因表達以及對各種細菌病害易感性增強［3］。有關NPR1在水楊酸介導的SAR途徑中的作用模式已有詳盡報道［4］。已知 SAR過程中，NPR1被轉運至細胞核內對于PR基因的轉錄激活是必需的，但NPR1蛋白質本身并不包含任何DNA結合序列，且行使生物學功能的兩個關鍵結構域(BTB/POZ，ankyrin repeat)均參與蛋白質相互作用的過程，這暗示著NPR1在SAR過程中起著一個間接的調控作用［2］。進一步的研究表明，NPR1出入細胞核的過程受到SA及類似物觸發的細胞內氧化還原電勢調控［5］。NPR1蛋白之間通常以二硫鍵鏈接而形成多聚體的形態存在于細胞質內，在受到SA誘導后，細胞內氧化還原電勢發生改變而引起二硫鍵被剪切，NPR1多聚體被還原成單體并被轉運到細胞核內。NPR1在細胞核內與轉錄因子TGAs或者NIMINs結合，從而影響轉錄因子的DNA結合效率，進而從轉錄水平上對下游防御基因進行調控［6，7］。此外，NPR1 亦能夠與擬南芥中與其本身同源的兩個蛋白——水楊酸受體NPR3，NPR4分別相互作用，且作用模式依賴于接收的SAR信號的強度，進而經由泛素化過程，來調節NPR1蛋白水平，這個過程對于擬南芥中SAR的建立同樣關鍵［4，8］。

為了進一步研究NPR1在植物防御反應中的作用，并闡明其在調節不同防御信號傳導途徑中的具體作用機制，本研究利用特異性引物擴增哥倫比亞野生型擬南芥中的NPR1基因，并將其分別克隆至pGBKT7、pGADT7酵母雙雜交表達載體上，為利用酵母雙雜交技術尋找與NPR1轉錄輔助因子相互作用的蛋白并進一步理解其在植物防御信號中的作用模式以及調控下游基因轉錄水平的機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

限制性內切酶(RE)EcoR I、BamH I、T4 ligase、PCR Mix、LongAmp Taq DNA polymerase、PMD19 － T載體購自Takara公司;瓊脂糖(Agarose)購自西班牙Biowest;質粒提取試劑盒購自Ambiogen公司;柱式DNA膠回收試劑盒、標準分子量DNA Marker購自Transgen公司;酵母用培養基購自Sigma;其他常用試劑均為分析純，購自上海國藥。

1.1.2 質粒與菌株

大腸桿菌DH5α，酵母菌株(Gold菌株)，表達載體pGBKT7、pGADT7均為湖南農業大學植物代謝實驗室保存。

1.2 方法

(1)引物設計。根據NCBI上查找到已公布的NPR1基因編碼區序列(CDS，全長1 782 bp)，運用引物設計軟件Primer Premier5，根據酵母表達載體pGBKT7、pGADT7的表達框及多克隆位點，在上下游引物5'端分別接入相應的酶切識別位點EcoR I及BamH I?？寺∷靡锞缮ど锕こ?上海)有限公司合成。實驗所用引物序列如下:

NPR1－F:5'GGAATTCCATGGACACCACCAT TGATGGATTCG 3'

NPR1－R:5'CGGGATCCCGTCACCGACGACG ATGAGAGAGTTTA 3'

(2)重組酵母雙雜交質粒示意圖如下:

圖1 pGBKT7_NPR1載體構建示意圖

圖2 pGADT7_NPR1載體構建示意圖

(3)PCR反應體系?？傮w積50 μL，無菌去離子水 20 μL，Buffer 6 μL，引物 (10 μM)各1.2 μL，long Taq(2.5 μL)1.2 μL，dNTP(10 mM)0.9 μL，模板cDNA(100 ng)1 μL(擬南芥 cDNA)。

反應參數:94℃ 變性 30 s，55℃ 退火 30 s，72℃延伸120 s，運行30個循環。

(4)T載體連接及大腸桿菌轉化。將PCR擴增得到目的片段和pMD19－T載體片段進行連接反應，體系為 10 μL(1 μL vector，4 μL DNA，5 μL solutionⅠ)(具體操作參見Takara公司試劑盒說明書)。

(5)酵母雙雜交載體構建。使用限制性內切酶EcoR I、BamH I對 PMD19－T_NPR1重組質粒和pGBKT7、pGADT7載體分別進行雙酶切(酶切體系參見Takara公司試劑盒說明書)，瓊脂糖電泳后回收目的基因片段和表達載體片段(操作參見Transgen公司試劑盒說明書)。在T4連接酶連接體系中將目的基因片段分別與兩個表達載體片段連接后，轉入大腸桿菌。挑取陽性克隆進行PCR驗證后提質粒進行酶切驗證。

1.3 重組質粒轉化酵母細胞

(1)酵母感受態細胞的制備。本實驗采用醋酸鋰介導轉化法分別將兩個重組質粒轉化至Gold酵母菌株(操作流程以及選用試劑參見Clontech公司MatchmakerTMGold Yeast Two－Hybrid System User Manual)。

(2)重組質粒的轉化。將鮭魚精 DNA、酵母感受態細胞以及重組質?；靹蚝蠹?.7 mL PEG/LiAc溶液，30℃振蕩培養30 min，再加入0.07 mL DMSO混勻，于42℃熱激15 min，冰浴15 min，離心后棄上清，將沉淀重懸于1.5 mL 1×TE緩沖液中，分別涂布至缺少相應氨基酸的SD篩選平板。28℃恒溫箱里倒置培養，直至長出酵母陽性克隆。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增擬南芥NPR1基因

圖3 LongAmp酶擴增得到的NPR1全長CDS

以引物的Tm降低5℃為基準，上下加減5℃設計退火溫度梯度 PCR，確定最佳的退火溫度為55℃。以55℃為退火溫度進行PCR擴增，PCR產物經過1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離出目的片段，大小與預期一致(1 800 bp左右)(圖3)。

2.2 NPR1全長CDS與T－Vector連接及測序結果分析

切膠回收擴增出的1 782 bp左右的目的片段，在T4連接酶作用下將其連接到pMD19－T，熱激法轉化大腸桿菌DH5α，取100 μL菌液涂布于LB固體培養基上(含有氨芐青霉素50 g/mL)生長，篩選獲得陽性克隆。隨機挑選數個單菌落進行PCR檢測，篩選獲得轉化子。

挑取菌落PCR檢測為陽性的單菌落，接種至含有50 mg/mL Amp的5～10 mL LB液體培養基中，37℃、220 rpm振蕩培養。過夜后提取質粒，利用EcoR I、BamH I進行雙酶切驗證。挑選驗證正確后的克隆測序，測序結果顯示去除酶切位點后序列長度為1 782 bp。經NCBI BLAST比對，與已公布的擬南芥NPR1全長CDS序列一致。

2.3 酵母表達載體的構建

將測序結果與已公布序列比對完全一致的NPR1片段與載體pGBKT7、pGADT7分別經EcoR I、BamH I雙酶切后，用T4連接酶連接，構建酵母雙雜交表達載體pGBKT7_NPR1與pGADT7_NPR1。將連接產物轉化大腸桿菌得到陽性克隆后，進行單、雙酶切驗證(圖4)。雙酶切后電泳檢測到約1 800 bp的目的片段，說明載體構建成功。用BamHⅠ進行單酶切時出現兩條帶可能是由于單酶切體系中的BamHⅠ錯誤識別堿基序列并進行切割或者由于質粒在大腸桿菌中進行復制時出現堿基突變所致。

圖4 pGBKT7_NPR1與pGADT7_NPR1質粒酶切結果

2.4 重組質粒的酵母菌轉化

將重組質粒pGBKT7_NPR1與pGADT7_NPR1分別轉化至Gold酵母菌株中，熱激轉化后將菌懸液涂布于SD/－Trp與SD/－Leu培養基上，28℃恒溫培養2～3 d后，觀察酵母菌的生長情況(圖5)。結果表明，重組質粒已成功轉入到宿主酵母菌細胞內。

圖5 含NPR1 CDS重組質粒的Gold酵母菌轉化子

3 討論與小結

在各種植物防御途徑中，SA介導的系統獲得性抗性(SAR)已見大量報道，并且被認為是植物應對細菌性病害過程中十分關鍵的機制［9］。SAR過程發生在受感染植株的健康部位中。植物局部組織受到病原菌侵染后，一類可移動的信號分子通過維管系統運輸至其它部位并且啟動相應的免疫應答反應［10］，如激素水平提高、防御基因表達、次級代謝物累積、形態學改變等。水楊酸作為SAR信號途徑起始位點中必不可少的一種信號分子，它介導著一大類編碼具有抗菌作用的蛋白質的基因表達［11］。在水楊酸信號傳導途徑中，NPR1被證明是必需的一個反式作用因子［3］。水楊酸信號導致細胞內氧化還原電勢的改變，NPR1被轉運進入到細胞核內，并與一些轉錄因子相互作用［12］，進而調控防御基因的轉錄［1，2，6，7，13］。然而，SA途徑與其它信號途徑的相互調節作用機理尚不清楚。因此，研究NPR1與其它可能參與調控的蛋白質相互作用模式十分必要。

本研究利用基因重組將擬南芥NPR1全長CDS分別克隆到酵母表達載體pGBKT7與pGADT7中。重組質粒通過大腸桿菌轉化獲得了陽性克隆，經過菌落PCR及單、雙酶切驗證重組質粒構建成功。將重組質粒又轉化到Gold酵母菌中，并且在相應篩選培養基上成功獲得了轉酵母菌成功的陽性克隆。本研究結果為利用NPR1進行酵母篩庫以及蛋白相互作用的驗證奠定了實驗基礎，有利于進一步研究NPR1與其它可能參與調控的蛋白質相互作用模式，進一步闡明NPR1在信號傳導途徑互作中行使的功能。

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