阿魏酸甲酯一氧化氮供體在小鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)測定

劉穎琳，李燕來，劉浩然，馬麗雪

（1.大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000；2.湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，長沙 410082）

阿魏酸是臨床上慢性腎小球腎炎的治療藥物之一〔1-2〕。一氧化氮在慢性腎病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。有研究表明，慢性腎病患者尿中一氧化氮濃度降低。在糖尿病腎病大鼠中，腎臟一氧化氮合成酶（NOS）活力下降，一氧化氮（NO）含量降低〔3-5〕。本課題組合成了三個(gè)阿魏酸NO供體衍生物，見圖1〔6〕。前期實(shí)驗(yàn)表明，其中阿魏酸甲酯供體衍生物（FEND）有較好的生物活性。我們選擇FEND測定其在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，為進(jìn)一步研究提供相關(guān)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

圖1 阿魏酸甲酯一氧化氮供體（FMND）

1 材料

1.1 動(dòng)物 ICR小鼠，雌雄各半，體重20～25 g，購于湖南斯萊克-景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（湘）-2009-0004。

1.2 藥品與試劑 阿魏酸甲酯一氧化氮供體（FMND），由湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院合成，經(jīng)HPLC檢測，純度達(dá)98.1%；甲醇（色譜純，美國Tedia試劑公司，批號(hào)：101113）；乙腈（色譜純，美國Tedia試劑公司，批號(hào)：101204）；超純水為自制品；其余試劑均為分析純。

1.3 儀器 島津高效液相色譜系統(tǒng)：LC-10AT vp二元溶劑輸送泵，SP-10A vp紫外檢測器；KQ-3200E型超聲波清洗器（上海精密儀器儀表有限公司）；WX-8渦旋混合儀（上海滬西儀器公司）；AL204型精密電子天平（瑞士梅特勒－托利多公司）。

2 方法

2.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），（瑞典Akzo Nobel公司）；檢測波長：322 nm；流動(dòng)相：甲醇－水＝70∶30；流速：1.0 mL/min。柱溫：30 ℃。進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 血漿樣本的制備 ICR小鼠66只，隨機(jī)分為11組，每組6只，雌雄各半。給藥前禁食12 h，自由飲水。將FEND混懸于0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液中，按50 mg/kg的劑量每組小鼠灌胃，分別于5、10、20、40、60、90、120、180、240、300、420、600 min各斷頭處死6只小鼠，取血，置于肝素化的EP管中，3000 r/min離心后取上清，備用。取0.3 mL血漿，加入1.0 mL乙酸乙酯，旋渦振蕩萃取2 min，8000 r/min離心5 min，吸取有機(jī)相，剩余溶液再加入1.0 mL乙酸乙酯，重復(fù)提取一次〔7〕。將兩次提取的有機(jī)相混合，于45℃水浴中在氮?dú)饬飨聯(lián)]干有機(jī)溶劑，加入流動(dòng)相100 μL溶解殘留物，旋渦振蕩l min，尼龍微孔濾膜（0.22 μm）過濾，進(jìn)樣20 μL。

2.3 方法專屬性考察 取小鼠空白血漿0.3 mL，按“2.2”項(xiàng)下操作，得空白血漿色譜圖。將一定濃度的FEND標(biāo)準(zhǔn)液（12.1 μg/mL）加入空白血漿中，按“2.2”項(xiàng)下操作，得樣品色譜圖。見圖2。

圖2 小鼠血漿HPLC譜圖

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密吸取100 μL小鼠空白血漿，置于EP管中，分別加入不同濃度的FEND對照品溶液，分別獲得濃度為1.21、2.42、4.84、12.1、24.2、36.3 μg/mL的FEND血漿溶液。按“2.2”項(xiàng)下處理樣品，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，每次進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖。以濃度為橫坐標(biāo)（C），以峰面積為縱坐標(biāo)（A），進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。FEND濃度與峰面積的線性關(guān)系為：A=74452.4 C+4322.3，r=0.9994。FMND的檢測限達(dá)到0.1 μg/mL。在1.21～36.3 μg/mL范圍內(nèi)線性良好。

2.5 精密度試驗(yàn) 配制FEND在血漿中的高、中、低3個(gè)不同濃度的樣品，于日內(nèi)及日間測定5次，計(jì)算樣品測得的濃度。

2.6 萃取回收率試驗(yàn) 取低、中、高3個(gè)不同濃度的FMND標(biāo)準(zhǔn)液，一部分經(jīng)過濾處理后直接進(jìn)樣，另一部分按“2.2”項(xiàng)下處理后進(jìn)樣。計(jì)算加空白血漿處理后的樣本濃度與直接進(jìn)樣的樣品濃度的比值，即為其萃取回收率。

2.7 穩(wěn)定性考察 將高、中、低3個(gè)濃度的FEND血漿樣品置于-20℃冰箱，分別于第10、20、30天后再測定其含量。

3 結(jié)果

3.1 專屬性實(shí)驗(yàn) 從圖2中可知，F(xiàn)END的保留時(shí)間為6.34 min，達(dá)到基線分離，峰形良好，血漿內(nèi)源性物質(zhì)不干擾其測定。

3.2 精密度與回收率 結(jié)果各血漿樣品測定方法的日內(nèi)及日間精密度RSD均小于2.0%，符合生物樣品測定的要求。高、中、低3種濃度的血漿樣品的相對回收率均高于85%，RSD均小于2.0%。見表1。

3.3 穩(wěn)定性 穩(wěn)定性檢測結(jié)果表明，F(xiàn)END血漿樣品在-20℃冰箱保存30 d以內(nèi)變化極小。說明樣品至少能在-20℃穩(wěn)定30 d。

表1 FMND在血漿中的萃取回收率測定（n=3）

圖3 ICR小鼠灌胃給予FMND后血藥濃度-時(shí)間曲線圖

3.4 藥動(dòng)學(xué)參數(shù) 小鼠灌胃給藥后，不同時(shí)間的平均血藥濃度-時(shí)間曲線。見圖3。用PKSlover 2.0軟件對血藥濃度－時(shí)間數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，根據(jù)（Akaike’s Information Criterion，AIC）選擇房室數(shù)，以AIC最小者為最優(yōu)選擇。結(jié)果FEND經(jīng)灌胃給藥后的藥動(dòng)學(xué)行為符合有時(shí)滯的二室模型。由藥動(dòng)學(xué)參數(shù)結(jié)果可知，其吸收半衰期為0.94 h，分布半衰期為1.04 h，消除半衰期為9.44 h。時(shí)滯為6.6 min。見表2。

4 討論

4.1 流動(dòng)相的選擇 本實(shí)驗(yàn)對FEND的流動(dòng)相條件進(jìn)行了考察。當(dāng)流動(dòng)相為甲醇－水（70∶30）時(shí)，F(xiàn)END樣本能與血漿內(nèi)源性物質(zhì)峰分離，且保留時(shí)間相對較為理想，峰形良好，適于檢測。

表2 ICR小鼠灌胃給予FMND后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（n=6）

4.2 血漿樣品處理方法的選擇 本實(shí)驗(yàn)對不同血漿樣品處理方法進(jìn)行了考察。前期實(shí)驗(yàn)中曾采用蛋白沉淀法和溶劑萃取法進(jìn)行處理。以乙腈、甲醇沉淀蛋白的方法進(jìn)行前處理，發(fā)現(xiàn)其回收率只能達(dá)到60%左右，乙腈沉淀法回收率稍高。溶劑萃取法則分別采用了氯仿和乙酸乙酯進(jìn)行處理。發(fā)現(xiàn)氯仿萃取后血漿內(nèi)源性雜峰較多，回收率70%左右。而采用乙酸乙酯萃取回收率達(dá)到80%以上，且血漿雜峰較少，故選用乙酸乙酯萃取法。

4.3 藥動(dòng)學(xué)結(jié)果的探討 以房室模型為基礎(chǔ)，利用軟件對幾種常見模型進(jìn)行了擬合。對于房室模型的選擇，常以擬合優(yōu)度參數(shù)AIC為重要依據(jù)。AIC＝N*InRe+2P，其中N為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的個(gè)數(shù)，P為所設(shè)模型的個(gè)數(shù)，Re為殘差平方和。以一室模型進(jìn)行擬合，AIC=38.3；以二室模型擬合，AIC=40.88；以有時(shí)滯的一室模型擬合，AIC=29.42；以有時(shí)滯的二室模型擬合，AIC=29.76。一般以AIC最小者為最優(yōu)模型。后二者之間AIC相差極小。但考慮到有時(shí)滯的二室模型相關(guān)系數(shù)r=0.9945，而有時(shí)滯的一室模型相關(guān)系數(shù)r=0.9924，最終選擇有時(shí)滯的二室模型為最佳擬合模型。從藥動(dòng)學(xué)參數(shù)可以看出，F(xiàn)MND能較快地吸收，分布半衰期并不太長（1.04 h），而消除半衰期較長（9.44 h）。與文獻(xiàn)報(bào)道的阿魏酸的藥動(dòng)學(xué)特點(diǎn)相比〔10-12〕，其吸收速度與阿魏酸相當(dāng)，而消除半衰期卻大大延長。

致謝：中國藥科大學(xué)藥劑教研室張勇博士為本研究提供PK Slover 2.0軟件。

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