同種異體脂肪干細胞復合脫鈣骨修復大鼠尺骨缺損

熊竹友 方小魁 徐靜 張莉 王琛 李光早

由于創傷、感染、腫瘤切除或先天性畸形等原因，造成臨界大小骨組織缺損的治療始終是修復與重建外科領域所面臨的挑戰之一，骨組織工程為這種骨缺損的修復和再生提供了新的治療策略[1-3]。脂肪干細胞（ADSCs）是存在于脂肪組織中的間充質干細胞。Zuk等[4]報道，經脂肪抽吸術獲得的脂肪組織中含有大量的ADSCs，并證明其與骨髓間充質干細胞（BMSCs）的免疫表型的一致性超過90%，陽性表達 CD29、CD44、CD71、CD70、CD105/SH2 和 SH3，不表達CD31、CD45等[5]。進一步研究發現，ADSCs能夠在體外向成骨、軟骨、脂肪、肌等多方向分化[6]。實驗證實，種植在支架上的ADSCs可以在免疫缺陷動物模型中形成成熟的骨組織[7-8]。

目前，對于ADSCs的研究多為單純的動物模型，包括裸鼠的皮下成骨、兔子的顱骨等[9-11]。人ADSCs 具有成骨潛能[4，6，12]，但是體內實驗仍局限于免疫缺陷的動物[7-8，13]。具有免疫功能的動物模型有助于我們更好地模擬人成骨的病理生理，本實驗探討同種異體ADSCs修復臨界大小管狀骨缺損的可行性，并進行長期觀察。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、材料與儀器

6只6月齡SD大鼠，雄性，體質量200～250 g（上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院動物實驗中心）。

脫鈣骨 （國家組織工程工程中心）；I型膠原酶（Washington Biochemical，USA）；胎牛血清（HyClone，USA）；LG-DMEM 培養液 （Gibco，USA）；1,25-dihy droxyvitamin D3、ascorbate-2-phosphate、β-glycerophosphate（Sigma，USA）；DIO（Oregon，USA）；Hoechst 33258 DNA（Sigma，USA）；ALP（Sigma，USA）。

掃描電鏡（FEI，USA）；激光共聚焦顯微鏡（Leica，Germany）。

1.2 rADSCs的分離培養

以20%烏拉坦5 mL/Kg腹腔注射麻醉動物，無菌條件下于兩側腹股溝處切取約8 mL的脂肪組織，于2 h內在超凈工作臺進行細胞的原代培養。具體方法如下：0.1 mol/L 磷酸緩沖液（PBS，pH 7.4）沖洗脂肪組織3遍，剔除脂肪組織中可見的筋膜和小血管，剪碎脂肪組織至0.5～1.0 mm3大小，以0.1%Ⅰ型膠原酶37℃振蕩（120 r/min）條件下消化60 min。等體積含10%FBS的LG-DMEM培養液終止消化，1 200 r/min離心10 min，棄去上清液，獲得高密度間質組織細胞團，以紅細胞裂解液處理5 min，除去摻雜的紅細胞，再過直徑100 μm的篩網，除去未完全消化的組織。所獲得的細胞以生長培養液（GM：LG-DMEM，10%FBS，100 mg/mL 鏈霉素，100 U/mL青霉素）重懸，以4×104cells/cm2的密度接種于直徑100 mm 的細胞培養皿中，37℃、5%CO2、100%濕度條件下常規培養，24 h后第一次換液，以后每周換液2次。當細胞長至70%～80%融合狀態時，以1∶3的比例傳代。選用第3代細胞進行后續實驗。

1.3 脫鈣骨材料的制備

本實驗所用的脫鈣骨為豬髂骨完全脫鈣處理后所得。將脫鈣骨修剪成3 mm×5 mm×8 mm大小，置于培養皿中備用。使用前將該支架材料用紫外線照射30 min，75%乙醇浸泡過夜，PBS漂洗3遍，在GM中37℃孵育過夜。接種細胞前在倒置相差顯微鏡下觀察，確定培養液中無細菌或真菌生長后，即可用于接種細胞。

1.4 細胞接種于脫鈣骨支架材料

收獲第3代rADSCs，調整細胞密度以適于不同的用途。采用將接種的細胞懸液反復滴加的方法，使接種細胞均勻分布于支架材料上。將細胞-脫鈣骨材料復合物放置于37℃、5%CO2、100%濕度的細胞培養箱內孵育4 h，待細胞黏附于材料上后，緩慢加入GM培養液，第二天更換成骨誘導液 （生長培養液 ，0.01 μM 1,25-dihydroxyvitamin D3，50 μM ascorbate-2-phosphate，10 mM β-glycerophosphate）繼續培養。

1.5 細胞在材料表面的生長情況

1.5.1 細胞在材料表面的黏附和細胞外基質分泌

將3×105cells/cm2密度的第 3代 rADSCs接種于裁剪好的脫鈣骨材料上，培養箱孵育4 h后加入GM，第二天換成成骨誘導液。分別于接種3、7和14 d后收集細胞-材料復合物，用掃描電鏡觀察rADSCs在脫鈣骨材料表面的黏附和細胞外基質分泌情況。2.5%戊二醛固定細胞-材料復合物4℃過夜，0.1 M的PBS清洗3遍，分別以25%、50%、70%、80%、95%的乙醇溶液以及梯度乙醇-六甲基二硅氮烷（HMDS）混合溶液（3∶1、1∶1 和 1∶3）、100%HMDS逐級脫水、干燥，每級10 min。然后對細胞-材料復合物表面噴金，掃描電鏡進行觀察并拍照。

1.5.2 DIO熒光標記觀測細胞在材料表面的增殖

將第3代rADSCs預先用 3,3’-DiOctadecyloxacarbocyanine perchlorate（DIO）熒光染料標記，接種材料后在誘導培養液中共培養。無血清LG-DMEM培養液以1∶250的比例稀釋DIO染液（1 mM），將稀釋后的染液重懸第3代rADSCs，調整細胞濃度為1×106cells/mL，混勻后在CO2培養箱中孵育20 min，1 000 r/min離心10 min，去上清液，以新鮮生長培養液重懸細胞，調整細胞密度為3×105cells/mL，接種于脫鈣骨材料表面（同一批次），細胞培養箱中培養4 h后，加入生長培養液，第二天更換成骨誘導液培養，分別于接種3 d、7 d和14 d后以熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡觀察細胞在三維支架上的生長情況，同時觀察細胞在脫鈣骨材料內部的分布情況。

1.5.3 細胞在三維材料上的增殖曲線

將第3代rADSCs以3×105cells/mL密度接種于脫鈣骨材料上（同一批次），培養箱孵育4 h后加入GM，第二天更換為成骨誘導液。以生長培養液作為對照組。 分別于接種 1、3、5、7、9、12 和 15 d 后收集材料上的細胞，以Hoechst 33258 DNA定量的方法對rADSCs進行細胞計數，對未接種細胞的脫鈣骨材料進行相同的處理，所測值作為空白對照從各檢測值中減去，利用測得熒光強度的OD值來反應細胞的生長趨勢。

1.6 rADSCs在脫鈣骨三維支架上成骨表型檢測

將第 3代 rADSCs以 3×105 cells/ml密度接種于3 mm×5 mm×8 mm大小的脫鈣骨材料上（同一批次，保證脫鈣率相同），培養箱孵育4 h后加入GM，第二天換成成骨誘導液。以生長培養液作為對照組，別于接種4、7、14、21和28 d后對各組進行ALP活性檢測和細胞外鈣鹽沉積檢測。

1.7 SD-大鼠尺骨臨界大小缺損模型的制備

第3代rADSCs－脫鈣骨復合物在體外誘導2周后用于回植實驗。未接種細胞的脫鈣骨作為對照組，與實驗組作相同處理。

取6只SD-大鼠，經腹腔緩慢推注20%烏拉坦（5 mL/Kg）行全身麻醉，兩側前肢備皮脫毛后俯臥位于手術臺上，常規消毒鋪巾，取尺骨中段縱形切口，逐層切開顯露尺骨，于尺骨中段制造8 mm長度骨缺損，并剔除兩斷端附近的骨膜，預防骨膜成骨的發生。根據之前的報道，管狀骨缺損的長度只要是直徑的3倍或者以上，就無法依靠機體自身的修復能力使其愈合[15]。將體外成骨誘導2周的rADSCs-脫鈣骨材料復合物植入左側缺損區，作為實驗側。右側缺損區植入單純脫鈣骨，作為支架對照側。無需固定植入物，逐層縫合肌肉、筋膜，關閉切口。術畢，每只動物注射40萬U青霉素，連續注射3 d。麻醉清醒后，分籠喂養，任其自由活動（圖1）。

1.8 DR檢測

術后8周、24周對實驗SD-大鼠行前肢行DR檢測，根據檢測結果來評價骨缺損的修復情況。

1.9 組織學檢測

獲取原始缺損部位的標本，并作相應標記。10%甲醛固定24 h后，放置于20%甲酸溶液中進行脫鈣，每隔3天更換一次脫鈣液。脫鈣完成的標準為針刺易穿入即可。標本流水沖洗過夜，脫水，透明，浸蠟及包埋，制成石蠟標本，切片厚度為5 μm，HE染色。

1.10 統計學分析

所有實驗均重復3遍，數據以均值±標準差表示。統計軟件為SPSS 17.0，采用方差齊性的獨立樣本t檢驗，P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 rADSCs脫鈣骨材料體外生長情況

脫鈣骨為立體多孔狀，具有一定的機械強度，孔徑不一，孔隙率和孔徑大小良好。掃描電鏡示脫鈣骨結構疏松，孔隙大且相互交通，呈多孔網狀結構。平均孔徑（348.98±51.68） μm，孔隙率（87.87±1.55）%，孔溝通率大于85%，制備成3 mm×5 mm×8 mm的近似圓柱體，和SD-大鼠尺骨缺損模型的尺寸一致（圖 2）。

細胞-材料復合物在成骨誘導液中共培養后，電鏡掃描顯示，培養3 d時細胞很好地黏附于材料表面，7 d時多數細胞呈長梭形，隨材料表面特征呈一定方向生長，形成完整細胞層。另可見細胞分泌大量的細胞外基質填充于支架間隙，且細胞均勻分布于脫鈣骨材料上（圖3）。

rADSCs經DIO熒光標記后，接種于脫鈣骨材料上，分別在誘導3 d、7 d后，以熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡檢測。誘導3 d，細胞呈彌散狀態分布在材料的邊緣；7 d時，絕大部分材料表面都被帶綠色熒光的細胞覆蓋，細胞密集程度高。通過Hoechst 33258 DNA定量檢測，發現細胞在脫鈣骨支架材料表面的增殖能力與細胞在培養皿中培養時的增殖能力一致（圖 4）。

2.2 rADSCs在脫鈣骨三維支架上成骨表型的檢測

為了明確rADSCs在三維支架材料上是否保持成骨誘導能力，我們分別于成骨誘導后4、7、14、21及28 d檢測ALP的活性，于成骨誘導后4、7、14和21 d檢測細胞外Ca2+含量。結果顯示，誘導組中，ALP從第4天就開始增加，到第14天分泌量達高峰，然后逐漸下降，至誘導后21 d，仍未見明顯的鈣鹽沉積減少。相反，無論是ALP的表達還是Ca2+的分泌，非誘導組都保持在相對較低的水平。和非誘導組相比，誘導組ALP的表達和Ca2+的分泌均更高，差異具有統計學意義（P<0.05）。說明在三維支架材料上，rADSCs仍然具有成骨誘導活性（圖5）。

2.3 DR檢測

骨缺損修復后的8周和24周，分別行DR檢測。實驗側已不能清楚地區分骨缺損斷端和材料的接合部，外側可見與長骨骨干一致的平行骨痂，可觀察到骨的輪廓和光滑的骨塑形。對照側骨斷端清楚，未見連續性骨痂，缺損多為纖維性連接（圖6）。

圖1 SD大鼠管狀骨缺損模型的建立Fig.1 The process of constructing the model of tubular bone defects on SD rats

圖2 脫鈣骨材料Fig.2DBM

圖3 細胞-脫鈣骨材料掃描電鏡觀察Fig.3 SEM observation of the rASCs-DBM scaffold

2.4 大體觀察和組織學檢測

大體觀察顯示，實驗側8周時骨缺損區可見少量骨樣組織修復，并與周圍骨組織相連；24周時見骨樣組織覆蓋修復。對照側8周時骨缺損處斷端為纖維樣組織充填，表面未見骨樣組織覆蓋；24周時單純脫鈣骨支架完全降解，形成骨缺損區（圖7）。

組織學檢測發現，實驗側為典型的再生骨組織，有大量的骨陷窩和骨細胞，亦可見部分骨小梁結構形成；對照側為膠原纖維樣組織和殘留的脫鈣骨基質，未見到大片的再生骨樣組織（圖8）。

圖4 rADSCs在脫鈣骨材料上的增殖能力Fig.4 Proliferation of rADSCs on the surface of DBM

圖5 rADSCs-脫鈣骨在體外成骨表型的鑒定Fig.5 The identification of osteogenic phenotype of rADSCs-DBM

圖7 大體觀察Fig.7 Gross view of repaired ulnar bone

3 討論

常用的治療骨缺損的方法都存在著一定的缺陷。而未分化干細胞移植治療是一種骨缺損修復的新方法。在實驗中，我們利用常規外科手術獲取供體（SD大鼠）雙側腹股溝處脂肪，培養得到的rADSCs用于其他SD大鼠，保證干細胞的同種異體性。將同種異體的rADSCs接種于脫鈣骨基質材料上，在體外經成骨誘導培養后形成組織工程骨，回植修復SD大鼠尺骨中段臨界大小（8 mm）的骨缺損，24周后，和對照側相比，實驗側骨缺損處有新的骨基質生成。

Dudas等[16]研究了接種于明膠海綿支架材料上的ADSCs成骨誘導后，修復兔非臨界大小的顱骨缺損。雖然有陽性結果，但是用細胞處理的實驗側和缺損處曠置的對照側沒有顯著差異，可能是因為設計的骨缺損過小（小于臨界大小缺損），以至于機體依靠自身的修復能力修復了缺損。根據文獻報道，超過8 mm的缺損為SD大鼠管狀骨臨界大小骨缺損[17]。

圖7 大體觀察Fig.7 Gross view of repaired unlar bone

圖8 組織工程骨缺損模型建立24周后組織學檢測Fig.8 Histological observation 24 weeks after implantation

種子細胞的作用一直受到爭議。有報道認為，單純應用支架材料或者是材料復合生長因子就能滿足骨缺損愈合的需要[18-20]。但也存在相反的意見，認為如果不接種種子細胞，則無法修復骨缺損[21-22]。研究發現，不接種種子細胞，僅僅在正常骨斷端的邊緣有極少量的骨質形成，大部分缺損區仍然為植入的殘留材料[23]。這也提示我們，在小的缺損中，通過支架材料的傳導作用，缺損部位的細胞可以爬行修復骨損傷；而在大范圍的缺損修復過程中，存在其他相適應的修復機制。通過BMSCs骨再生實驗可知，接種的BMSCs不僅能提供骨形成必需的成骨細胞，還能分泌促進缺損修復的生長因子[24-26]。ADSCs在修復骨缺損過程中是否具有同樣的功能，目前尚不清楚。為了闡明ADSCs的修復機制和體內的長期轉歸，以綠色熒光蛋白（GFP）標記的ADSCs植入骨缺損部位，檢測其分泌的生長因子的研究正在進行中。

除了種子細胞，支架材料也是組織工程中不可或缺的一部分。骨組織工程的支架材料不僅要有良好的孔隙率和生物相容性，以利于細胞黏附、增殖、基質沉積，還要具備一定的機械強度。有研究比較了ADSCs分別在聚乳酸（PLA）和纖維素包被的PLA表面的成骨分化能力，結果ADSCs在纖維素包被的PLA表面的增殖分化能力更強。說明接種的材料對ADSCs的誘導成骨能力有一定的影響[27]。骨組織經脫鈣處理形成脫鈣骨基質，具有骨傳導性和骨誘導性[28]，異體移植后無免疫排斥反應[29]，是骨組織工程常用的一種生物衍生材料。國內外對利用脫鈣骨基質成功構建組織工程骨的研究都有相關報道[30-31]。但關于ADSCs與脫鈣骨的組織相容性及構建組織工程骨修復骨缺損的研究仍不多。在本實驗中，我們發現接種于脫鈣骨上的rADSCs與在二維環境下培養的細胞具有相似的增殖能力，并且保持著很高的ALP活性及Ca2+沉積水平，說明rADSCs在三維支架材料上仍然擁有很強的成骨分化潛能。

以ADSCs構建組織工程骨的研究，大多是利用自體的細胞源或是在裸鼠體內進行。雖然有報道認為，ADSCs和BMSCs相似，具有弱免疫原性[32]。但是，關于同種異體ADSCs修復骨缺損鮮有報道。本實驗用同種異體的rADSCs構建組織工程骨修復SD大鼠尺骨臨界大小的骨缺損，植入體內后1周，手術區無紅腫、滲液等炎性反應，傷口一期愈合；24周取出標本，材料周圍組織未見壞死、化膿、積液，材料與周圍軟組織結合好，無包膜形成，呈實質樣結構。HE染色也未見樣本周圍有炎性細胞浸潤。 提示了同種異體ADSCs能與受體很好地相容，免疫排斥反應小。為ADSCs作為骨組織工程的種子細胞，進一步構建骨組織工程的種子細胞庫奠定了基礎。

本實驗中，雖然我們利用同種異體的ADSCs成功修復了SD大鼠尺骨臨界大小的骨缺損，但是同種異體ADSCs組織工程骨修復管狀骨缺損的長期效果如何？其體內免疫耐受的機制是什么？這些問題還需要我們進行更為深入地探索。

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