骨髓間充質干細胞體外構建組織工程化半月板

李丹 周廣東 劉浥 殷宗琦 汪振星 祝聯(lián)

半月板是位于膝關節(jié)內股骨髁與脛骨平臺之間的兩塊半月形纖維軟骨板，具有傳導負荷、吸收震蕩、維持膝關節(jié)穩(wěn)定、提高關節(jié)面吻合度、改善關節(jié)軟骨的潤滑和營養(yǎng)等功能[1-2]。半月板損傷是骨科常見疾病，治療多采用半月板部分或完全切除術，早期效果比較滿意，可有效減少半月板損傷帶來的急性期癥狀，如疼痛、腫脹、關節(jié)交鎖等[3]，但長期效果差，可能出現(xiàn)慢性疼痛、股四頭肌萎縮和關節(jié)退行性病變等，甚至可導致骨關節(jié)炎的發(fā)生[4-6]，給患者帶來極大的痛苦并嚴重影響生活質量。因此，半月板損傷的治療成為臨床亟待解決的難題之一，尋找半月板替代物成為研究熱點，包括自體移植[7-10]、異體移植[11-12]、異種移植[13]和假體置換[14-15]等方法。 但是，各種方法都存在著無法避免的缺陷，并不能有效地解決半月板替代物這一問題。近年來，隨著組織工程學的興起，應用組織工程方法構建半月板組織，為實現(xiàn)半月板的無損傷修復提供了可能性。

目前，組織工程構建半月板的研究，多針對半月板部分缺損進行修復，并不能應用于臨床上半月板完全缺損的情況。已有的構建完整組織工程化半月板的研究，主要采用軟骨細胞作為種子細胞[16]，但軟骨細胞存在來源有限、增殖能力差、體外大量擴增后易老化及去分化等缺點。骨髓間充質干細胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）具有來源充足、取材方便、創(chuàng)傷小、增殖能力強、無排斥反應、不存在倫理問題等優(yōu)點，是目前較為理想的種子細胞。研究認為，應用BMSCs修復半月板局部缺損效果良好[17]，但目前尚未有應用單純BMSCs構建完整組織工程化半月板的報道。本實驗室之前的研究結果已經(jīng)證實，BMSCs通過體外誘導體系，可以生成較成熟均質的軟骨樣組織，但能否在體外成功構建出體積較大的半月板形軟骨樣組織，尚需更為深入的探索。本研究中，我們應用BMSCs作為種子細胞，擬在體外構建完整的具有較成熟軟骨組織形態(tài)和一定力學強度的組織工程化半月板。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6月齡比格犬2只 （上海甲干生物科技有限公司），雌雄不限。實驗操作依照《關于善待實驗動物的指導性意見》，動物均獲得人道主義對待。

1.2 實驗材料與儀器

胰蛋白酶（Hyclone公司，美國）；低糖DMEM培養(yǎng)基（Hyclone公司，美國）；高糖DMEM培養(yǎng)基（Hyclone 公司，美國）；胎牛血清（Hyclone 公司，美國）；青霉素-鏈霉素-兩性霉素B（Hyclone公司，美國）；磷酸鹽緩沖液（Hyclone公司，美國）；細胞計數(shù)試劑盒（CCK-8，東仁化學科技有限公司，上海）；無紡PGA纖維（組織工程國家工程中心，上海）；生物力學分析儀（Instron公司，美國）。

1.3 原代BMSCs的分離培養(yǎng)及擴增

1.3.1 BMSCs的獲取

速眠新（0.05～1 mL/Kg）和氯胺酮（5 mg/Kg）肌注麻醉比格犬，髂骨處剃毛，常規(guī)新潔爾滅酊消毒，鋪無菌手術巾。用肝素化的無菌骨穿針以90°垂直于髂骨平面進行穿刺，進入髓腔后抽取10 mL骨髓，置于已肝素化的無菌離心管中。

1.3.2 全血培養(yǎng)法

含標本的離心管中加入低糖DMEM培養(yǎng)基約30 mL，混勻制成細胞懸液，2 000 r/mim離心8 min，輕輕吸除漂浮的脂肪及大部分上清液，重新振蕩混勻，再重復洗滌離心2次。

吸除上清液，振蕩，細胞重懸，取少量細胞懸液用4%乙酸等體積稀釋，破壞紅細胞，常規(guī)計數(shù)有核細胞數(shù)。加入含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素-兩性霉素B的低糖DMEM培養(yǎng)基 （BMSCs培養(yǎng)液），稀釋至 4×106cells/mL，然后按 6×105cells/cm2細胞密度接種于培養(yǎng)皿內。

將接種好的培養(yǎng)皿置于37℃、5%CO2、100%飽和濕度下培養(yǎng)5 d后，進行首次換液。換液時先輕輕搖動培養(yǎng)皿使未貼壁的紅細胞浮起，吸除含大量紅細胞的培養(yǎng)液，用BMSCs培養(yǎng)液洗滌2～3次，此時低倍鏡下可見到多個克隆形成。加入含2 ng/mL堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）的BMSCs培養(yǎng)液，繼續(xù)在相同條件下培養(yǎng)。3～4 d后細胞達到80%融合狀態(tài)時，進行傳代培養(yǎng)。

1.3.3 體外傳代擴增

原代細胞70%～80%融合時，吸除培養(yǎng)液，加少量PBS洗滌1次，然后加0.25%胰蛋白酶1 mL進行消化。鏡下見大部分細胞胞質回縮、形態(tài)變圓后，加入等量BMSCs培養(yǎng)液中止消化。收集細胞懸液，計數(shù)并按 1∶4 傳代，以（1～1.5）×104 cells/cm2細胞密度接種于新的培養(yǎng)皿內，繼續(xù)在相同條件下培養(yǎng)。隔日換液，3～4 d后達到近70%～80%融合狀態(tài)，繼續(xù)傳代培養(yǎng)。傳至第2代，細胞量即已足夠用于構建。

1.4 細胞生長曲線

將第1代到第3代細胞以1 000個/孔接種于96孔板，用BMSCs培養(yǎng)液培養(yǎng)。每個96孔板接種一個代次的細胞，每板接種6行，每行接種5個孔。分別于第 1、3、5、7、9、11 天用細胞計數(shù)試劑盒檢測。每次檢測一行。先將培養(yǎng)基吸盡，加入100 μL DMEM 及 10 μL CCK-8 試劑，37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下孵育2 h后，用酶標儀測定450 nm處的吸光度，根據(jù)OD值繪制細胞生長曲線。

1.5 半月板模具的制備

根據(jù)正常半月板的結構，通過計算機輔助設計和快速成型方法，利用超硬石膏及Optosil歐印C類硅橡膠，制備半月板模具。

1.6 PLA/PGA材料制備

55 mg無紡PGA纖維壓制在半月板形的模具中，將含0.1%PLA的二氯甲烷溶液均勻滴在PGA纖維上，使PGA/PLA混合材料達到61.1 mg。支架材料應儲存于密閉負壓的狀態(tài)，使用前用75%乙醇浸泡45 min消毒，PBS沖洗2次后吸干備用。

1.7 BMSCs-PLA/PGA復合物體外培養(yǎng)

將第2代BMSCs制備成6×107cells/mL的細胞混懸液，均勻接種于支架上，37℃、5%CO2、飽和濕度下放置4 h，移入50 mL聚丙烯離心管，加入30 mL BMSCs培養(yǎng)液。2 d后換液，5 d后改用軟骨誘導液（高糖 DMEM 培養(yǎng)基加入 10 μg/L TGF-β1、50 μg/L IGF-I、40 μg/L DEX、50 mg/L VC、10 mL/L ITS、40 mg/L脯氨酸）培養(yǎng)，隔日換液。6周后，收集樣本檢測。

1.8 組織學檢測

體外培養(yǎng)6周時，取標本進行大體觀察，然后將標本以4%多聚甲醛固定24 h，脫水、石蠟包埋，切片 （厚度為5 μm），HE染色及Safranine O染色，觀察組織結構及細胞外基質分泌情況。

1.9 生物力學檢測

將組織工程化半月板軟骨隨機切取三處全厚軟骨樣本，均修剪成4 mm×4 mm×2 mm的長方體，以最大負荷300 N的壓力，0.5 mm/min的位移速度加壓，當變形到90%時停止加壓，計算出極限抗壓載荷及楊氏模量[18]。

1.10 統(tǒng)計學分析

以SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，相關生物力學定量指標以均數(shù)±標準差表示，采用單因素方差分析，P<0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 不同代次BMSCs細胞生長曲線

原代BMSCs接種后即時觀察，可見大量圓盤狀血細胞混于其中。24 h后細胞貼壁，呈梭形散在分布。5 d后首次換液，洗去血細胞，加入含bFGF的BMSCs培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞。光鏡下原代至第2代BMSCs，形態(tài)無明顯變化。生長曲線表明，第1代到第3代BMSCs擴增能力無明顯差異。本實驗選用第2代細胞進行構建（圖1）。

2.2 體外構建組織大體及組織學觀察

細胞接種于支架材料后，形成細胞－材料復合物，體外培養(yǎng)5 d后，大體、光鏡及掃描電鏡結果顯示，BMSCs與PGA相容性良好，細胞均勻附著于材料生長，細胞和材料清晰可辨，并且已分泌少量細胞外基質。體外培養(yǎng)2周后，掃描電鏡顯示已形成豐富的細胞外基質，將細胞及材料基本包裹在內。而6周后大體觀可見BMSCs-PLA/PGA復合物能夠較好地維持半月板三維立體結構，同時形成了表面光滑、有彈性的軟骨樣組織，但存在輕微收縮現(xiàn)象（圖2）。切開觀察截面發(fā)現(xiàn)，復合物出現(xiàn)空心現(xiàn)象（圖3）。

HE染色可見典型的軟骨陷窩出現(xiàn)，說明形成了較成熟的軟骨組織。但復合物中央部分無軟骨形成，僅有少量材料的降解產(chǎn)物，即出現(xiàn)空心現(xiàn)象。Safranin'O染色呈強陽性，證明有蛋白聚糖基質產(chǎn)生（圖 4） 。

為了解決收縮及空心問題，同樣通過計算機輔助設計和快速成型的方法調整模具大小，并在制備材料時減小材料支架的厚度，采用多層疊加技術，解決中空問題（圖5）。組織學染色可顯示，空心問題得到明顯改善（圖6）。

2.3 體外構建組織生物力學檢測

生物力學檢測顯示其抗壓彈性模量達正常半月板組織的12.7%，即具備一定的力學強度（圖7）。

圖1 不同代次BMSCs形態(tài)學觀察及細胞生長曲線（40×）Fig.1 Morphological observation and growth curve of BMSCs in different passage(40×)

圖2 體外預構建細胞材料復合物Fig.2 Pre-constructed cell material compound in vitro

圖6 模具修改后組織工程化半月板組織學觀察Fig.6 Histological observation of tissue engineered meniscus after modifying the mold

圖3 空心現(xiàn)象Fig.3 Hollow phenomenon

圖4 體外構建的組織工程化半月板組織學觀察Fig.4 Histological observation of tissue engineered meniscus constructed in vitro

圖5 修改模具后體外預構建細胞材料復合物Fig.5 The BMSCs-PGA/PLA construct after modifying the mold

圖7 生物力學檢測結果（P<0.05）Fig.7 Result of biomechanical test(P<0.05)

3 討論

半月板是膝關節(jié)的重要結構之一，在維持關節(jié)穩(wěn)定方面發(fā)揮著巨大作用。而半月板損傷是臨床上膝關節(jié)外科中的一個難題。

本研究中，我們把經(jīng)4%多聚甲醛固定后的比格犬完整半月板作為參照物，通過計算機輔助設計和快速成型的方法，制備出具有精確形態(tài)的陽模及與之相對應的陰模，并通過這套半月板陰陽模具，將PGA無紡棉加工成具有半月板精確形態(tài)的支架材料，再以一定比例加入PLA進行定型。通過利用PLA對PGA進行包埋，不僅使支架材料形態(tài)維持良好、結構更加緊密，同時有助于提高其力學性能。但PLA含量過高不利于細胞黏附，過低又不利于形態(tài)的維持。根據(jù)本實驗室前期研究結果[19]，確定最佳PLA含量為10%，支架材料在同等厚度條件下具有最佳孔徑率和最大細胞吸附率，有助于成功構建具有精確形態(tài)的組織工程化半月板。

另外，目前組織工程化半月板的研究大都停留在體外培養(yǎng)較短時間的細胞材料復合物。這類復合物尚未形成軟骨樣組織，其中存在著大量未降解材料，回植到動物體內后會引起較為嚴重的炎癥反應。并且，力學強度較差，對回植手術要求較高。而在我們的研究中，BMSCs－材料復合物通過體外誘導培養(yǎng)6周后，HE染色可見典型的軟骨陷窩形成，僅中央部分存在少量材料降解產(chǎn)物。Safranine O染色呈強陽性，證明有蛋白聚糖基質產(chǎn)生。這些均證明復合物已形成較為成熟均質的軟骨樣組織，且殘存的未降解材料量較少，降低了回植體內后的炎癥反應，保證了軟骨的良好形成。同時，生物力學檢測結果顯示，所構建的組織工程化半月板具有一定的力學強度，降低了回植手術的操作難度。

本研究發(fā)現(xiàn)，由BMSCs-材料復合物誘導形成的組織工程半月板容易出現(xiàn)收縮和空心現(xiàn)象，即體積縮小并且復合物外周部分有軟骨形成，而中央的部分無組織或是僅有少量的PGA降解產(chǎn)物。可能的原因是：①根據(jù)本實驗組早期結果分析，BMSCs二維或三維培養(yǎng)比較容易出現(xiàn)“抱團”現(xiàn)象，其原因及機制尚不清楚；②TGF-β1是目前所發(fā)現(xiàn)的最為重要的促誘導因子之一，但是TGF-β1可能會刺激成纖維細胞合成α-平滑肌肌動蛋白增加，使成纖維細胞收縮而致構建組織的三維結構扭曲，而出現(xiàn)收縮現(xiàn)象；③當復合物的厚度>2 mm時，中央?yún)^(qū)域的細胞不易得到外周營養(yǎng)，代謝產(chǎn)物也不易排出，而影響該部分的軟骨樣組織形成。在后期，由于外周細胞獲得營養(yǎng)充分，代謝旺盛，其基質迅速分泌而先期形成外周軟骨層，這種似包囊樣結構進一步阻礙了營養(yǎng)物質及生長因子的運輸，從而使得中央?yún)^(qū)細胞活力下降甚至死亡，從而產(chǎn)生空心現(xiàn)象。針對這個問題，我們對模具進行了調整，使其比正常半月板稍大，這樣不僅解決了復合物收縮的問題，同時也方便回植前針對實際情況對復合物進行修剪，以排除個體差異的干擾。另外，我們調整支架材料的厚度，采用多層疊加的方式解決了空心問題[20]。在回植動物體內前，根據(jù)不同個體半月板厚度不同，將適宜個數(shù)的復合物疊加植入。這樣既解決了空心問題，又增強了力學強度，同時可以根據(jù)個體差異調整所植入復合物的厚度。

本研究認為，BMSCs可通過軟骨誘導體系的培養(yǎng)，在體外誘導分化成為較成熟的軟骨組織，進而構建出組織工程化半月板。這種新的半月板替代物，可能會為臨床上半月板的損傷提供更簡便有效的治療方法。

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