稀酸水解綠潮藻及發酵制生物丁醇研究＊

衣 丹，高春蕾，王能飛，龐 敏，張學雷

（國家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島266061）

近年能源危機引起了世界對未來供應不足的普遍關注，促使人類尋求可再生能源。丁醇是重要化工原料，也是極具潛力的新型生物燃料［1］。聯合國國際能源署將生物丁醇列為第二代生物燃料［2-3］。但是傳統生產生物丁醇的原料淀粉、糖蜜成本高昂，約占丙酮丁醇發酵總成本的60%［4］，成為丙酮丁醇發酵工業缺乏競爭性的重要因素。同時，隨著地球上人口的急劇膨脹，食品用糧及工業用糧均感嚴重不足。而纖維資源是自然界有機物中分布最廣、生產量最大的可再生生物質能源。我國對纖維生物質能源的開發利用主要集中在秸稈、玉米芯、稻草、廢棄木材等，而對海藻生物質能源的研究相對較少，我國綠潮藻滸苔資源十分豐富，僅福建沿海每年的產量就在10萬t以上，養殖海域中一年四季均可發生［5］。2008年以來，我國南黃海連續3年爆發綠潮藻，且規模和生物量一年比一年大，如何處置和利用如此巨大的海藻，已成為我國綠潮藻災害防災減災重大項目研究內容之一［6］。因此探索利用綠潮藻滸苔纖維生產燃料成為生物質能源發展戰略的重要組成。

目前，能進行丁醇發酵的微生物有Clostridium acetobutylicum，C.beijerinckii，C.saccharoperbutylacetonicum和C.saccharobutylicum四種［7］。由于溶劑產生菌不能直接有效利用纖維素，因此纖維原料必須先經預處理（物理法、化學法或生物法）成為單糖再進行發酵［8］。本研究通過稀酸法［9-10］從綠潮藻滸苔中提取還原糖，考察不同條件下滸苔渣的水解情況，并以滸苔渣水解液為底物以丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）作為發酵菌，發酵生產丁醇，探討利用綠潮藻滸苔生產丁醇技術，實現海洋生物質資源的高效利用。

1 材料與方法

1.1 滸苔藻種

2011-08采自青島海區漂浮的綠潮藻，主要種類為滸苔（Enteromorphaprolifera）。用干凈海水沖，除去雜物，曬干，放于干燥避光通風處儲存備用。

1.2 菌 種

丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）CICC8016，購自中國工業微生物菌種保藏中心。

1.3 儀器與試劑

p H計PHS-3C，生化培養箱GNP-9080BS-Ⅲ，分光光度計UV754N，自動壓力蒸汽滅菌鍋GI54DS，氣相色譜儀Agilent GC（6890N），實驗中所用化學試劑為分析純。

1.4 培養基

種子培養基的成分（g／L）：葡萄糖10；胰蛋白胨5；酵母粉5；大豆蛋白胨5；K2HPO40.5；MgSO4·7H2O 0.2；FeSO4·7 H2O 0.01；L-半胱氨酸0.5。將培養基在115℃下滅菌15 min，熱處理的孢子懸濁液在37℃條件下培養14～16 h后作為接種液。

發酵培養基：滸苔水解液經過抽濾、中和、滅菌后作為碳源，添加其他營養成分作為發酵培養基。

1.5 實驗方法

1.5.1 滸苔水解反應條件

將曬干滸苔用粉碎機粉碎，過40目篩備用。在250 m L三角燒瓶中加入一定體積和質量分數的硫酸，加入一定量的滸苔渣并混勻，研究硫酸質量分數、料水比、水解溫度和水解時間對滸苔渣水解效果的影響。設計反應條件如下：1）硫酸質量分數為1%，1.5%，2%，2.5%，3%，4%，5%；2）料水比（g∶m L）為1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25；3）反應溫度為90，100，110，120，130℃；4）水解時間為10，20，30，40，50，60，90，120 min。

1.5.2 滸苔水解液發酵

以10%接種量轉接種子液到發酵培養基（50 m L培養基于總容積為150 m L的厭氧培養瓶）中，37℃靜置發酵72 h。發酵結束后，取2 m L樣品，8 000 r／min離心10 min后，取上清液，保存于-20℃冰箱，待測。

1.5.3 溶劑質量濃度測定

用氣相色譜Agilent GC（6890N）測定溶劑各組分，FID檢測器。色譜條件：色譜柱Thermo TGWAXMS（30.0 m×320μm×0.5μm），柱溫箱程序升溫：起始50℃，以5℃／min升到150℃，保持10 min，進樣溫度160℃，FID檢測器溫度250℃，H2流速30 mL／min，空氣流速300 mL／min，載氣N2流速4 m L／min，進樣量0.2μL，分流比5∶1。

1.5.4 糖質量濃度測定

總還原糖質量濃度測定分別采用DNS法［11］。

1.5.5 計算方法

還原糖提取率／%=還原糖質量濃度×水解液體積／滸苔渣干重×100%

丁醇得率／%=丁醇質量濃度／發酵液還原糖質量濃度×100%

溶劑轉化率／kg·kg-1=溶劑產量kg／滸苔渣干重kg

2 結 果

2.1 滸苔稀酸水解

2.1.1 硫酸質量分數對還原糖質量濃度和提取率的影響

在料水比為1∶15、溫度為120℃、水解時間為30 min的反應條件下，考察不同的硫酸質量分數對滸苔渣水解還原糖產率的影響，實驗結果（圖1）顯示：隨著酸質量分數的增加，還原糖質量濃度不斷升高，對實驗儀器的腐蝕越強，硫酸質量分數過高又會破壞葡萄糖等單糖分解成羥甲基糠醛、類黑素等［12］影響發酵，且還原糖提取率在硫酸質量分數＞3%后，上升幅度不大，因此確定稀酸水解適宜的硫酸質量分數為3%。

圖1 硫酸濃度對還原糖質量濃度和提取率的影響Fig.1 The effect of sulfuric acid concentrations on concentration and extraction rate of reducing sugar

2.1.2 料水比對還原糖質量濃度和提取率的影響

在溫度為120℃，硫酸質量分數為3%，水解時間為30 min的反應條件下，考察不同料水比對滸苔渣水解還原糖產率的影響，實驗結果（圖2）顯示：在料水比小于1∶15時，水解液中還原糖提取率隨著料水比的增大而升高顯著；料水比大于1∶15后，還原糖提取率的增加相對減小。這是因為料水比較小時，滸苔渣和硫酸混合不均勻，硫酸不能完全浸入，不利于水解，所以提取率不高。同時還原糖質量濃度隨料水比的增加逐漸降低。當料水比為1∶25時，還原糖提取率雖然最高，但還原糖質量濃度只有19.12 g／L對后續的單糖利用不利。綜合以上實驗結果料水比采用1∶15最合適。

圖2 料水比對還原糖質量濃度和提取率的影響Fig.2 The effect of solid-liquid ratio on concentration and extraction rate of reducing sugar

2.1.3 反應溫度對還原糖質量濃度和提取率的影響

在料水比為1∶15，酸質量分數為3%，水解時間為30 min的反應條件下，考察溫度變化對滸苔渣水解還原糖產率的影響。實驗結果如圖3所示：在90℃時反應幾乎不進行，100℃還原糖的質量濃度和提取率很低，之后隨著溫度的升高，反應速率加快，還原糖質量濃度及提取率快速提高，但在高溫下生成的單糖會受熱降解，因此，實驗選取最適宜溫度為120℃。

圖3 反應溫度對還原糖質量濃度和提取率的影響Fig.3 The effect of temperature on concentration and extraction rate of reducing sugar

2.1.4 反應時間對還原糖質量濃度和提取率的影響

在料水比為1∶15，酸質量分數為3%，水解溫度為120℃的反應條件下，考察反應時間對滸苔渣水解還原糖產率的影響，實驗結果如圖4所示：隨著反應時間的延長，還原糖的質量濃度和提取率不斷升高，在60 min后還原糖的質量濃度和提取率隨時間的延長變化很小，綜合考慮在實驗中選擇反應60 min。

圖4 反應時間對還原糖質量濃度和提取率的影響Fig.4 The effect of treating time on concentration and extraction rate of reducing sugar

經過以上稀酸水解條件的優化，得到水解液的還原糖質量濃度為32.78 mg／m L，還原糖提取率為49.17%。

2.2 滸苔稀酸水解液發酵制丁醇

2.2.1 氮源對丁醇發酵的影響

以中和處理后的滸苔渣水解為發酵培養基，在其中添加質量分數0.2%的不同氮源（硫酸銨、氯化銨、乙酸銨、檸檬酸銨、硝酸銨、尿素），并以不加任何氮源的原始發酵液為對照，進行發酵培養。從圖5分析可知，丙酮丁醇梭菌可利用多種無機氮源。硝酸銨為氮源時丁醇質量濃度很低；以乙酸銨為無機氮源時，丙酮的質量濃度明顯高于其它發酵，這是由于乙酸銨含有乙酸基，在丁醇發酵時乙酸基轉化為丙酮，從而增加了丙酮的質量濃度；總體來說與不添加任何氮源的水解液進行發酵對比，氮源的種類對發酵影響不大，其中以硫酸銨為氮源時發酵的丁醇質量濃度效果最好。

圖5 氮源種類對丁醇發酵的影響Fig.5 The effect of nitrogen source on fermentation for butanol production

2.2.2 初始糖質量濃度對丁醇發酵的影響

高質量濃度的還原糖底物對丙酮丁醇梭菌有較強的抑制作用，為防止底物對生物體的毒害作用，需將底物濃度維持在一定范圍。

從圖6分析可知隨著還原糖質量濃度的增加，丁醇產量也是隨之增加，還原糖質量濃度超過30 g／L丁醇產量開始下降，分析原因可能是過高的還原糖質量濃度對丙酮丁醇梭菌的生長具有一定的抑制作用，還原糖量過高產生過多的丁酸或乙酸也同時對它的代謝構成一定的負面作用。質量濃度在20～40 g／L之間時，還原糖達到較高的利用率，而且比較穩定。當還原糖質量濃度為30 g／L時，產生的丁醇達到最大值，產量為3.39 g／L。

圖6 初始糖濃度對丁醇發酵的影響Fig.6 The effect of initial reducing sugar concentrations on fermentation for butanol production

2.2.3 稀酸水解液丁醇發酵結果

由表1可知，在中和后的發酵液中添加2%的硫酸銨，還原糖質量濃度為30 g／L時，發酵72 h，丁醇質量濃度達到3.39 g／L，總溶劑質量濃度達4.29 g／L，丁醇得率為11.3%，總溶劑轉化率為0.069 kg／kg。

表1 稀酸水解液丁醇發酵結果Table 1 The result of hydrolysate fermentation for utanol production

3 討 論

大型綠潮藻滸苔已經連續多年在青島近岸聚集，影響人們正常生活和城市旅游業的發展，滸苔是具有開發潛力的大型海藻，目前我國對滸苔資源的利用還僅限于作為食品、飼料原料和某些生物活性物質的提取。利用滸苔作為生物質資源生產清潔燃料，是滸苔資源綜合利用的重要選擇，對解決我國生物質能資源短缺具有重要意義。

秦松等［13］發明了滸苔經過預處理、稀酸水解（不需經過酶解），發酵液用氫氧化鈣中和至中性，直接用于制備生物乙醇技術。張維特等［6］采用酸水解法利用滸苔生產乙醇，用5%硫酸在90℃下處理70 min，經釀酒酵母S2發酵后乙醇質量濃度為2.1 g／L，乙醇得率為26%，但是所用硫酸濃度較高，對儀器設備有一定損害。本研究利用稀酸預處理可以使滸苔渣中纖維素降解，通過單因素試驗確定稀酸預處理的條件為：硫酸質量分數3%、料水比1∶15、溫度120℃下處理60 min，可得還原糖濃質量濃度為32.78 g／L，還原糖提取率為49.17%。所得還原糖質量濃度與張維特［6］用質量分數5%硫酸預處理所得還原濃度39.73 g／L的結果比稍低，但是硫酸質量分數要小對儀器設備損害小，對還原糖破壞性低。根據初始糖質量濃度對丁醇發酵的影響實驗，32.78 g／L的還原糖質量濃度更接近理想的發酵底物濃度，不用稀釋，可以直接用于接下來的丙酮丁醇梭菌發酵。

綠潮藻滸苔中的纖維素和半纖維素的質量分數為33.7%，是良好的纖維素生物質來源［14］，目前以滸苔為原料生產丁醇還未見報道。國內厭氧發酵生產生物丁醇的主要原料為玉米、谷物、薯干等淀粉質糧食資源。如何利用廉價非糧食原料生產丁醇來降低其生產成本，成為該產業所必須直面的問題。相關研究人員正在嘗試用纖維資源替代糧食作物，用于作為丁醇發酵的原料有玉米、水稻、小麥的秸稈，甜菜蜜糖、稻草等。

本研究以滸苔渣稀酸水解液中和后作為發酵液，被丙酮丁醇梭菌8016有效利用，在添加質量分數2%的硫酸銨，還原糖質量濃度為30 g／L時，厭氧發酵后可產丁醇3.39 g／L。滸苔經稀酸處理和溶劑發酵，1 kg干滸苔渣可產0.069 kg溶劑，而理論上1 kg玉米可生產0.265 kg溶劑，1 kg糖蜜（含蔗糖50%）可生產0.15 kg溶劑，1 kg干稻草可生產0.103 kg溶劑［4］，因此1 kg干滸苔渣可相當0.26 kg玉米、0.46 kg糖蜜或0.67 kg干稻草。可見，綠潮藻滸苔水解液的丙酮丁醇發酵有著巨大的潛在應用價值。隨著預處理方法的改進，水解液脫毒處理，相信可以進一步提高丁醇產量，也是今后的研究方向。

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