南極冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L RNA解旋酶CiDDX5的基因特征及其表達分析＊

宓妍妍，王 燕，黃曉航，劉晨臨＊

（1.山東輕工業學院 食品與生物工程學院，山東 濟南250353；2.國家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島266061）

DEAD-box RNA解旋酶能介導NTP依賴的雙鏈RNA解旋，利用ATP依賴的RNA酶催化RNA二級結構的構象變化，在許多RNA參與的代謝活動中發揮關鍵作用。DEAD-box RNA解旋酶參與RNA轉錄、前體mRNA剪切、核糖體發生、核質運輸、蛋白質翻譯和RNA降解等重要的生命活動，廣泛存在于從病毒到人類幾乎所有已知的生命形式中［1］。

越來越多的研究表明，DEAD-box RNA解旋酶參與植物細胞中的各種代謝過程，具有廣泛的生理意義，并且在對逆境的適應中具有重要作用［2］。2000年，Chamot等［3］在藍藻中發現了一些冷誘導的基因，RNA解旋酶基因就是其中之一［4-7］。除溫度以外，RNA解旋酶基因還受光照、氧氣和滲透壓等條件變化的影響［8］。2005年，在擬南芥中發現1個DEAD-box RNA解旋酶基因發生突變，這個DEAD-box RNA解旋酶與m RNA輸出、植物發育和逆境反應有關系［9］。集胞藻PCC6803只有1個RNA解旋酶基因，即crh R（sir0083），它的表達也受低溫誘導，還在一定程度上受組氨酸激酶基因hik33的影響［2，7］。研究表明，crh R突變使groES，groEL1和groEL2分子伴侶基因的轉錄不受低溫誘導上調表達［8］。RNA解旋酶可能直接或間接地影響某些酶或蛋白質的合成，因而在生物的逆境適應過程中發揮作用。

本研究從南極分離到一株嚴格嗜冷的海冰衣藻Chlamydomonas sp.ICE-L，嚴酷的極地生境造就了生活在海冰環境中的真核光合微藻（冰藻）獨特的生物學特性。在南極海冰的形成、生長和融化的季節性變化中，冰藻也經受了溫度、光照等生態條件的劇烈變化。溫度和鹽度是影響海冰中冰藻種類生存的主要因素，Chlamy domonas sp.ICE-L對低溫、高鹽等逆境具有很強的適應能力。實驗室培養發現，受正常海水3倍的鹽度變化，其最適生長溫度為4～10℃。目前對DEAD-box RNA解旋酶基因的研究主要集中在人類，以及玉米，水稻，藍藻和集胞藻等植物方面，對于極地浮游植物的研究還很少。

本研究通過對篩選到的1條南極冰藻DEAD-box RNA解旋酶CiDDX5基因進行生物信息學分析，并研究其在低溫、高鹽環境中表達量的變化，探尋DEAD-box RNA解旋酶基因的功能，為揭示南極冰藻在低溫、高鹽環境中的適應機制提供參考和依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

南極冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L分離自由中國極地研究所（上海）提供的南極中山站（69°S，77°E）附近的浮冰中。采用Provasoli培養基培養，培養條件為：溫度7℃，光照強度1 300～1 600 lx，光照周期12 h／12 h L／D。南極冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L的RNA解旋酶基因序列來自于本實驗室構建的南極衣藻Chlamydomonas sp.ICE-L EST文庫，測序由上海桑尼生物技術有限公司完成。

1.2 DEAD-box RNA解旋酶基因的生物信息學分析

DEAD-box RNA解旋酶CiDDX5基因的開放閱讀框（open reading frame，ORF）分析通過NCBI網站（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov）進行，用DNAStar軟件包中的EditSeq軟件預測蛋白的理論分子量和等電點。通過 SWISS-MODEL［10-12］（http：／／swissmodel.expasy.org／）網站預測 RNA 解旋酶基因的三級結構。

將測定的CiDDX5基因序列用BLAST軟件與GenBank（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov）中已知的其他RNA解旋酶基因序列進行比對。選取相似性較高的序列［13］用BioEdit軟件進行對位排列，人工校正和合并序列。用MEGA 4.0［14］軟件分析中的緊鄰法（neighbor-joining method，NJ）推測系統關系，構建系統發育樹，通過自展檢測法（bootstrap test）估計所構建的系統發育樹的可靠性，重復次數為1 000次。

運用DNAStar軟件將Chlamydomonas sp.ICE-L的CiDDX5基因和其它3個遺傳距離較近的綠藻DEAD-box RNA解旋酶基因進行氨基酸序列同源性分析。

1.3 CiDDX5基因定量表達分析

1.3.1 樣品處理

低溫脅迫處理，在-20℃避光條件下，將7℃培養的對數期南極冰藻Chlamy domonas sp.ICE-L樣品分別處理0.5，1，3，6和12 h。以7℃避光處理0 h和12 h的混合樣品作為對照。

高鹽脅迫處理，將正常海水鹽度（33）培養的對數期南極冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L樣品濃縮后置于3倍海水鹽度（99）的培養基中，正常光照條件下分別處理0.5，1，3，6和12 h，以正常鹽度海水培養0 h和12 h的混合樣品作為對照。

樣品離心收集，液氮迅速冷凍后放入-80℃冰箱保存。分別用液氮研磨后立即進行RNA提取。

1.3.2 RNA提取

采用CTAB法［15］提取南極冰藻ICE-L的總RNA：1）將研磨好的藻樣加到600μL CTAB裂解液（2 g CTAB，1 g PVP，0.585 g EDTA，8.182 g NaCl，100 m L DEPC處理水）中，60℃水浴10 min；2）加入等體積的氯仿-異戊醇（24：1，V／V），抽提兩次，4℃，13 000 rpm離心10 min；3）加入1／4體積10 mol／L的LiCl溶液，-20℃沉淀2～3 h；4）用75%乙醇洗滌沉淀兩次，加入30μL DEPC處理水溶解沉淀；5）用瓊脂糖凝膠電泳檢測所提RNA的質量并用紫外分光光度計檢測所提RNA的濃度和OD260／OD280。

提取出的RNA用全式金反轉錄試劑盒（北京全式金生物科技有限公司）進行反轉錄，用于實時定量PCR。

1.3.3 實時定量PCR

根據南極冰藻ICE-L的CiDDX5基因序列，利用Primer 5.0軟件設計所需特異性引物，并由北京市理化分析測試中心代為合成。選擇磷酸甘油醛脫氫酶GAPDH和核糖體蛋白RLP19這兩對基因作為本次實驗的參比基因，引物序列見表1。

在熒光定量PCR儀（Mx3000，美國Stratagene公司）上進行擴增和數據分析。反應體系為10μL，反應程序：95℃5 min；95℃10 s，63℃20 s，72℃20 s，40個循環；循環后升溫至95℃，再降至63℃，以0.5℃遞增至95℃。

將實驗重復3次。數值取3次重復的平均±SE，通過2-ΔΔCt方法［16］計算低溫和高鹽條件下不同誘導時間對ICE-L的CiDDX5基因表達的影響。

表1 實時定量PCR引物Table 1 The primers of Real-Time PCR

2 結果與分析

2.1 CiDDX5基因的序列分析

測序分析表明，CiDDX5基因全長為2 077 bp，含有1個完整的開放閱讀框，編碼513個氨基酸。預測該基因編碼的蛋白的理論分子量為74.5 k Da，等電點為9.14。

將預測的CiDDX5氨基酸序列進行Protein Blast分析發現其含有DEAD-box解旋酶的保守結構域和解旋酶超家族C端的保守結構域（圖1）。

圖1 Blast分析CiDDX5基因可能含有的功能域DEADc：DEAD-box解旋酶的保守結構域；HELICc：解旋酶超家族C端的保守結構域Fig.1 Potential functional domains of the CiDDX5 gene by Blast analysis DEADc：DEAD-box helicase domain；HELICc：Helicase superfamily C-terminal domain

2.2 CiDDX5基因的蛋白質三級結構預測分析

將ICE-L的CiDDX5的氨基酸序列提交到SWISS-MODEL預測分析，發現其與數據庫中，來自人類的2種解旋酶Ddx5（P68）和Ddx3x的功能蛋白相似度最高。分別達到49%和41%，具有同源模建的意義。表2中a和b兩個肽段的功能分別為鎂輔因子和ATP結合位點。

表2 預測CiDDX5所含兩個肽段的信息Table 2 The information of two predicted peptides of the CiDDX5

2.3 CiDDX5氨基酸序列的系統發育分析

從構建的CiDDX5序列的系統發育樹可以看出，綠藻、高等植物和真菌分別構成了3個獨立的分支，CiDDX5蛋白序列與萊茵衣藻，團藻和膠球藻等綠藻的相關序列聚類在一起，說明CiDDX5的蛋白結構與其所屬物種的分類地位是相關的（圖2）。

圖2 CiDDX5序列的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of CiDDX5 sequence constructed by the neighbor joining method

2.4 CiDDX5氨基酸序列同源性分析

運用DNAStar軟件將CiDDX5氨基酸序列和3種綠藻的氨基酸序列進行同源性比對，從分析結果可看出ICE-L與萊茵衣藻，團藻和膠球藻的同源性較高，分別為66%，65%和64%。將ICE-L的CiDDX5的氨基酸序列與其它3種單細胞綠藻的RNA解旋酶蛋白序列進行比對，發現其編碼DEAD-box RNA解旋酶特有的9個保守的氨基酸基序（圖3），說明CiDDX5屬于DEAD-box RNA解旋酶。但是，CiDDX5蛋白中的保守氨基酸基序與其它綠藻的DEAD-box RNA解旋酶的保守序列不完全一致。在所有9個保守基序中Motif Q的保守性最差，4種不同綠藻的Motif Q均有不同組成的氨基酸。CiDDX5的保守基序MotifⅧ是YIHRLGRTGR，其它綠藻的均為YVHRIGR。

圖3 ICE-L CiDDX5和3種不同DEAD-box RNA解旋酶氨基酸序列同源性分析Fig.3 Amino acid sequence comparison ICE-L CiDDX5 and other representative DEAD-box RNA helicases.

2.5 CiDDX5基因定量表達分析

在-20℃冰凍脅迫條件下，南極冰藻經不同時間的處理過程后，CiDDX5基因的表達量發生了明顯的變化（圖4）。隨著處理時間的延續，該基因的表達量逐漸升高，處理3 h時，CiDDX5基因的相對表達量達到最大值，此時表達量為未經低溫處理組的1.8倍，之后開始降低；在處理12 h后，CiDDX5基因的相對表達量降為對照組的一半。

圖4 -20℃ 低溫脅迫下CiDDX5基因的定量表達Fig.4 The quantitative expression of the CiDDX5 gene under low temperature stress of-20℃

檢測經過3倍鹽度培養處理的冰藻CiDDX5基因表達量的變化，其實時定量PCR的結果見圖5。在高鹽脅迫下CiDDX5基因的表達量持續升高，在6 h處理后表達量達到最大值，為對照組的2.9倍，在12 h略有降低。在所選取的處理時間段內，處理組基因的表達量都是高于對照組。表明在高鹽脅迫下，CiDDX5基因的表達量較低溫處理條件下發生了更為明顯和持久的變化，提示該基因在冰藻應對高鹽脅迫方面可能發揮更重要的作用。

圖5 3倍鹽度脅迫下ICE-L DEAD-box RNA解旋酶基因的定量表達Fig.5 The quantitative expression of the CiDDX5 gene under salinity stress of 3 times

3 討 論

越來越多的研究表明，植物中RNA解旋酶的表達受到各種生物和非生物脅迫的影響［2，8，15-16］。在本研究中，克隆得到了南極冰藻Chlamydomnas sp.ICE-L的RNA解旋酶CiDDX5基因，進行了生物信息學分析，并研究了冰藻的該基因在低溫和高鹽脅迫下表達量的變化。

解旋酶是存在于原核生物和真核生物中的一個龐大蛋白類群，分為5個（超）家族，即SF1～5。DEAD-box RNA解旋酶屬于SF2家族成員［2］，根據保守的DEAD模體的序列差異分為DEAD，DEAH，DECH和DEVH類群，這些類群的蛋白中均包含特征性的保守基序結構［2］。CiDDX5蛋白中包含了所有9個保守性模體結構，因而可以推定它是DEAD-box RNA解旋酶蛋白。DEAD-box RNA解旋酶蛋白中的保守基序與其生化功能有密切關系，其中Motif V和MotifⅧ共同參與ATP的水解，而模體Ⅵ則與RNA的解鏈有關。CiDDX5中的模體V為DEAD，而模體Ⅵ為SAT，這與DEAD類群的DEAD-box RNA解旋酶蛋白中的模體序列相一致。

在植物中DEAD-box RNA解旋酶的表達受到生物以及非生物條件的影響。在低溫脅迫下Av DH1和STRS1的表達可能在早期調節機制中發揮作用；而在高鹽脅迫下上述兩基因的表達可能起到長期調節的作用［17-18］。從本研究中可以看出，低溫脅迫下CiDDX5基因的表達量在處理3 h時達到了最大值；而在高鹽脅迫下，在處理12 h時基因仍具有很高的表達量。以上研究結果與Liu等［19］在高等植物中所做的研究結果相一致。

Gong等［20］發現在冷脅迫的條件下，DEAD-box RNA酶缺陷型的植物中，mRNA在從細胞核輸出到細胞質的過程中受損。Zhu等［21］研究結果表明，RNA代謝過程的調節對于植物的低溫適應是非常重要的，DEAD-box RNA解旋酶在生理調節方面的重要作用。藍藻中DEAD-box RNA解旋酶的有關研究表明，crh R編碼的RNA解旋酶可能通過改變mRNA的構象，影響其在低溫下的穩定性，從而調節某些基因的表達水平；這種對二級構象的調節可能是某些mRNA在低溫下指導蛋白合成所需要的。對擬南芥的相關研究表明，低溫脅迫下At RH25和At RH9兩種RNA解旋酶的表達都會發生上調。本研究初步揭示了CiDDX5在南極冰藻低溫、高鹽環境脅迫下表達量的變化，分析了其可能的分子作用機制。在今后的研究里，還需要進一步對其是否是ATP依賴型、其受到脅迫的信號調節分子是什么，以及其靶向作用的m RNA的類型等方面進行更為深入的研究，以期加深對南極冰藻RNA解旋酶的了解，進一步揭示南極冰藻在極端環境條件下的適應機制。

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