特異性免疫對哮喘患兒自然殺傷細胞和嗜堿性細胞的影響

黃瑞如

目前，對過敏性哮喘的治療通常采取的是吸入激素與支氣管擴張劑等方法，但該法通常只能治標，不能治本，而特異性免疫治療則可以起到標本兼治的功效[1]。本研究主要就特異性免疫治療對哮喘患兒自然殺傷細胞和嗜堿性細胞的影響進行分析，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2010年3月-2012年2月收治120例對屋塵螨過敏的哮喘患兒。男72例，女48例；年齡在3～14歲，平均年齡為（7.73±1.56）歲。114例為輕度哮喘，6例為中度哮喘。將其隨機分成對照組60例和試驗組60例。兩組患兒年齡、性別、病情輕重等方面差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。詳見表1。

表1 兩組患者的一般資料

1.2 治療方法 對對照組患兒予以12個月療程的吸入糖皮質激素治療。試驗組在對照組基礎上給予特異性免疫治療。此治療分為兩個步驟開展：（1）初始治療：按照注射液濃度可以分為 4種，即 100SQ-U/mL、1000SQ-U/mL、10000SQ-U/mL、100000SQ-U/mL。1周進行1次注射，注射量分別為100SQU/mL：0.2mL、0.4mL、0.8mL，1000SQ-U/mL：0.2mL、0.4mL、0.8mL，10000SQ-U/mL：0.2mL、0.4mL、0.8mL，100000SQ-U/mL：0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.8mL、1.0mL。初始治療階段患兒所能接受的最大劑量即為維持劑量。(2)維持治療：通常以100000SQ-U/mL的1.0mL作為維持劑量。在維持治療階段，2周進行第一針的注射，4周再進行第2針的注射，每隔6周施行一次維持劑量注射治療[2]。需要注意的是，在每次注射的前后，需要對患兒的血壓進行測量、對心肺功能進行檢查，并檢測PEF值，且注射完畢后，務必對患兒進行30min的診室觀察，看是否存在不良反應，若有不良反應應及時采取對應措施。

1.3 測定指標

1.3.1 自然殺傷細胞活性的測定 取3mL肝素抗凝靜脈血，并用PBS液按照2∶1的比例進行稀釋，再利用淋巴細胞分離液對淋巴細胞進行分離，之后用RPMP1640對其進行2次洗滌，控制細胞數為每毫克2×106以備用；以RPMP1640（10%的小牛血清含量）對細胞系K562進行連續傳代，經過1～2d傳代后，按照效應細胞洗滌方法對靶細胞進行洗滌，控制細胞數為每毫克2×105以備用；細胞毒實驗配備自然殺死細胞試驗管、最大釋放管、自然釋放管，以NP40對靶細胞進行破壞，以作最大釋放。在96孔酶標板中加樣，并于5%CO2、37℃的溫箱中進行2h的培養，再將LDH底物混合液加入孔內（混合液的成分為PMS、INT、輔酶I），用490nm酶標儀進行讀數[3]。自然殺傷細胞活性的計算公式為：自然殺傷率=（測定管-自然釋放管）/（最大釋放管-自然釋放管）×100%。

1.3.2 嗜堿性細胞的測定 取1mL的EDTA抗凝靜脈血，將 CD3-PerCP單抗20μL和CRTH2-AlexaFlour647單抗5uL加入100μL的血樣中，置于避光的室溫環境中進行15min的孵化；加入經1∶10稀釋的2mL裂解液于上述樣本中，用于紅細胞的溶解，經過10min的溫室避光處理后，2270×g離心5min，棄上清液[4]；加入2mL PBS液于上述樣本中，1次清洗之后，離心并棄上清液，再加入PBS液，最后進行上機檢測。嗜堿性細胞的測定選用流式細胞儀，上述單克隆抗體來自于BD公司。

1.3.3 DP-IgE、血清總IgE以及ECP水平的測定 DPIgE與ECP選用瑞典 熒光酶標法進行測定。血清總IgE的測定采用的是我院實驗室的同位素放射免疫法。

1.4 統計學方法 本次實驗數據采用SPSS13.0軟件統計分析。計量資料比較采用t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 治療前后兩組自然殺傷細胞的活性、嗜堿性細胞的表達、DP-IgE、血清總IgE以及ECP水平變化情況

對照組患兒自然殺傷細胞活性為（10.12±2.51）%，相比于實驗組患兒的（12.02±1.39）%明顯要低，組間差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

表2 兩組患兒自然殺傷細胞的活性、嗜堿性細胞、DP-IgE、血清總IgE以及ECP水平變化（）

表2 兩組患兒自然殺傷細胞的活性、嗜堿性細胞、DP-IgE、血清總IgE以及ECP水平變化（）

組別 病例 自然殺傷細胞（%） 嗜堿性細胞（%） DP-IgE（級） 血清總IgE（IU/mL） ECP（μg/L）治療后 差值 治療后 差值 治療后 差值 治療后 差值 治療后 差值對照組 60 10.1±2.4 1.5±2.4 0.4±0.1 0.2±0.1 2.9±1.2 0.9±0.8 29.2±28.7 8.8±13.2 505.8±531.6 237.9±97.8試驗組 60 12.0±1.5 3.0±1.8 0.4±0.1 0.2±0.2 2.8±1.2 1.4±1.3 27.6±19.7 11.2±15.6 390.9±337.9 329.1±297.2 P值 0.00 0.00 0.14 0.00 0.72 0.03 0.58 0.14 0.80 0.00

2.2 兩組患兒在治療前后的哮喘急性發作次數、PEF與C-ACT評分情況 兩組患兒在經過治療后，哮喘急性發作次數與治療前相比顯著減少；兩組PEF與C-ACT評分都比治療前顯著升高，實驗組優于對照組患兒（P<0.05）。見表3。

表3 兩組患兒在治療前后的哮喘急性發作次數、PEF與C-ACT變化（）

表3 兩組患兒在治療前后的哮喘急性發作次數、PEF與C-ACT變化（）

組別 病例 哮喘急性發作次數（次） PEF（%） C-ACT評分治療前1年 治療后1年 治療前 治療后 治療前 治療后對照組 60 4.6±2.6 1.8±1.1 18.1±2.3 24.3±1.4 86.9±5.9 92.1±5.6試驗組 60 4.6±2.8 0.9±0.8 17.5±2.7 25.5±1.4 87.7±7.1 97.4±6.1 P值 0.67 0.00 0.36 0.00 0.63 0.00

3 討論

哮喘是一類兒童多發病，長時間反復哮喘會對兒童的身心造成嚴重危害[5]。本研究主要分析特異性免疫治療對哮喘患兒自然殺傷細胞和嗜堿性細胞的影響，結果表明，經特異性免疫配合吸入激素治療后的患兒，哮喘急性發作次數較治療前顯著減少，同時也比經常規的吸入糖皮質激素治療的效果要好；此外，哮喘的PEF與C-ACT測定結果提示，經特異性免疫配合吸入激素治療后，其控制哮喘的效果比常規治療更加理想，且患兒的病情更加穩定。

通過研究，特異性免疫機制可對變態反應中的很多環節均有作用，不但對阻斷性IgG4抗體的合成起到促進作用，還對特異性IgE抗體的合成起到抑制作用，同時還對特異性IgE抗體和效應細胞的結合形成阻礙，對組胺的釋放起到抑制作用。經特異性免疫治療后，患兒的CD25+CD4+調節性T細胞增多[6]，同時產生一些免疫變化，比如Th2轉變為Th1，IL-10增多等，使患兒機體的免疫耐受情況更好。

自然殺傷細胞為哮喘發病機制的一種效應細胞。該細胞在分泌與合成細胞因子方面發揮著很大作用，比如IFN-γ與IL-10等抗炎因子在抑制氣道炎癥方面有著突出的功能：IL-10可以促進阻斷性IgG4抗體的合成，進而阻斷特異性IgE抗體的合成，以此對依賴IgE的肥大細胞與嗜堿性細胞的活化作用起到下調作用[7]。

本研究結果表明，試驗組患兒在經過1年的治療以后，其自然殺傷細胞的活性比對照組明顯要高，這與以往的相關研究保持一致；試驗組患兒DP-IgE與血清總IgE的下降水平也比對照組明顯要高，表明自然殺傷細胞的活性得到了提升，促進相關細胞因子的合成，而對IgE的合成起到抑制作用，進而在特異性免疫反應中發揮作用。此外，哮喘急性發作次數減少的另外一個原因就是，隨著自然殺傷細胞活性的提高，患兒機體發生感染的幾率也相對降低。

本研究表明，試驗組患兒在經過1年的治療以后，其嗜堿性細胞含量對比對照組明顯下降。作為一類始動細胞，嗜堿性細胞會釋放過敏反應物、趨化因子、組織胺等，容易引發過敏性炎癥，是哮喘急性發作的活性因子。而糖皮質激素則能有效減少嗜堿性細胞含量，配合特異性免疫治療，則能對外周血嗜堿性細胞的數量起到進一步的減少作用，該作用機制仍需不斷研究。

綜上所述，特異性免疫配合吸入糖皮質激素用于哮喘患兒的治療，其控制哮喘的效果比常規治療更加理想，且患兒的病情更加穩定；同時，此種治療方案還能有助于自然殺傷細胞活性的顯著提高，并對嗜堿性細胞含量進行相應減少。

[1]趙瑜，陳偉，譚永強，等.特異性免疫治療對哮喘患兒自然殺傷細胞和嗜堿性細胞的影響[J].臨床兒科雜志，2013，31(1):73-76.

[2]王成秀，符州，龔財惠，等.特異性免疫治療對哮喘患兒的免疫干預作用及肺功能的影響[J].實用兒科臨床雜志，2005，20(4):315-317.

[3]馬敏，馬恒貴，曹蘭芳，等.NK細胞活性在小兒哮喘塵螨特異性免疫治療中的意義[J].臨床兒科雜志，2007，25(12):1011-1013.

[4]向莉，申昆玲，張鴻燕，等.哮喘患兒對標準化塵螨特異性免疫治療劑量遞增階段的耐受性[J].中國實用兒科雜志，2006，21(12):924-926.

[5]向莉，王煒，馮暉，等.屋塵螨特異性免疫治療的哮喘患兒對塵螨過敏原免疫反應的變化[J].生物醫學工程與臨床，2011，15(5):470-474.

[6]彭萬勝，閆會麗，陳信，等.螨變應原舌下特異性免疫治療螨致敏哮喘患兒療效的 Meta分析[J].中國循證兒科雜志，2009，4(1):29-38.

[7]魏金鳳，劉恩梅，陳坤華，等.塵螨特異性免疫治療前后哮喘患兒過敏原變化趨勢[J].重慶醫科大學學報，2010，35(2):313-316.