多發性骨髓瘤患者骨髓骨硬化蛋白表達及其臨床意義分析＊

王曉桃，唐愛林，聶宇薇，劉 健，劉 玲

（桂林醫學院附屬醫院血液科，廣西桂林541001）

多發性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種常見的惡性腫瘤，居血液系統惡性腫瘤第2位，其突出的臨床特點之一是骨髓瘤骨病（myeloma bone dsease，MBD）。MBD的臨床表現包括彌漫性骨質疏松、高鈣血癥、溶骨性改變、病理性骨折、骨痛或上述幾種病變同時存在［1］。MBD發生機制的關鍵在于骨髓瘤細胞激活破骨細胞（osteoclasts，OC）的同時抑制成骨細胞（osteoblast，OB）活性。近年來，Wnt信號轉導途徑對OB分化及活性的調節是 MBD機制研究的熱點［2］。一旦瘤負荷增長到一定的水平，瘤細胞或骨髓基質細胞會產生一些Wnt信號拮抗物（如分泌型Fz相關蛋白等），抑制β－鏈蛋白（β－cate－nin）及下游的信號通路［3］。分泌型Fz相關蛋白主要有骨硬化蛋白（sclerostin）和 Dickkopfs（Dkks），有文獻報道 MBD患者存在DKK－1基因過度激活［4－5］。本研究通過檢測 MM患者骨髓中sclerostin水平，探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2007年1月1日至2012年3月31日在本院住院治療的 MM患者及缺鐵性貧血（iron deficient anemia，IDA）患者。MM患者納入標準：符合張之南主編的《血液病的診斷和療效標準》關于 MM的診斷標準。排除標準：（1）血清膽紅素升高，丙氨酸氨基轉移酶、天門冬氨酸氨基轉移酶高于正常上限2倍，心功能2級以上，距離較大的手術28d以內；（2）女性患者處于妊娠或哺乳期；（3）合并其他惡性腫瘤（非惡性黑色素瘤除外）；（4）合并嚴重感染或代謝性疾病。IDA患者納入標準：符合張之南主編的《血液病的診斷和療效標準》關于IDA的診斷標準，剔除經過治療的患者，入選前均征得患者及家屬的同意。納入研究的MM患者中男29例，女24例；年齡48～74歲，中位年齡65歲；其中33例為初診患者，20例為復發患者；免疫分型中IgG型18例，IgA型12例，IgD型4例，輕鏈型19例。臨床ISS分期Ⅱ期19例，Ⅲ期34例。采用門診、電話及通信方法對患者進行隨訪，隨訪時間為6～65個月，平均隨訪時間為（34.1±18.6）個月。以同期住院的30例IDA患者為對照組，其中男14例，女16例；年齡15～58歲，中位年齡46歲。上述兩組患者年齡及性別基線資料有可比性。所有MM患者均進行X線檢查：包括顱骨、頸椎、胸椎、腰椎、肋骨、肱骨、股骨及骨盆，以確定有無溶骨病變或骨質疏松；對X線檢查陰性者，還將進行MRI或CT檢查。血清校正鈣濃度＝（40－清蛋白）×0.02＋血清鈣。以X線檢查為標準，參考文獻［6］將BMD分為1級（普遍的骨質疏松）4例（7.55%），2級（骨質破壞在2處以下）21例（39.62%），3級（骨質破壞大于或等于2處、壓縮性骨折或病理性骨折）28例（52.83%）。

1.2 儀器與試劑 sclerostin酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（美國R＆D公司），Trizol試劑（Invitroge公司），sclerostin逆轉錄－聚合酶鏈反應（RT－PCR）試劑盒（上海微晶生物制品有限公司）。sclerostin上游引物5′－TCC CCA CCA CCC CTT TG－3′，下游引物5′－GGT CA CGT AGC GGG TGA A－3′，片段長度76bp，內參照為3－磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH），上游引物5′－ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC－3′，下 游 引 物 5′－TCC ACC ACC CTG TTG CTG－3′，片段長度486bp。自動酶標讀數儀（國產DG－3022）；Fluor ChemTM8900凝膠成像系統（美國Alpha Innotech公司）。

1.3 標本采集 取骨髓5mL，經肝素抗凝處理后，緩慢加入已裝有5mL淋巴細胞分離液的離心管中，2 000r／min離心30min，留取上清液以備用；同時提取中間單核細胞（BMMNC）置于另一干燥離心管中以備用。

1.4 方法

1.4.1 ELISA 定量檢測標本sclerostin含量，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，實驗重復3次，取均值。

1.4.2 RT－PCR 檢測骨髓BMMNC sclerostin的表達：（1）提取骨髓液BMMNC；（2）Trizol一步法提取細胞總RNA；（3）反轉錄合成cDNA；（4）進行PCR擴增。PCR反應總體積為25 μL，94℃變性2min并激活Taq酶，其后94℃變性40s，退火1min（GAPDH 56 ℃，sclerostin 60 ℃），72 ℃ 延 伸1min，GAPDH、sclerostin分別為35、40個循環，最后72℃補齊5 min。取5μL的PCR擴增產物在2%瓊脂糖凝膠上電泳鑒定，0.5μg／mL EB染色10min，然后在紫外檢測儀上觀察，用Fluor ChemTM8900凝膠成像系統進行分析。

1.5 統計學處理 采用SPSS18.0統計軟件處理數據，計量資料以±s表示，等級資料用中位數（最小值，最大值）表示，兩參數比較采用t檢驗，兩因素相關采用簡單相關及等級相關（Spearman）分析，生存分析采用 Kaplan－Meier法并用log－rank檢驗，檢驗水準α＝0.05。

2 結 果

2.1 MM組與對照組骨髓上清液中sclerostin水平 sclerostin水平高于對照組x±2s為顯著增高，MM組中有27例（51.9%）增高，其骨髓上清液中sclerostin的水平（0.54±0.21）pg／mL明顯高于對照組（0.31±0.06）pg／mL（t＝5.67，P＝0.00）。在MM組中，復發難治的MM患者骨髓sclerostin水平（0.65±0.17）pg／mL明顯高于對照組及初診的 MM患者（0.47±0.21）pg／mL（t＝8.44、3.27，P＜0.01）。本研究用RT－PCR進一步驗證大部分 MM患者骨髓BMMNC分泌sclerostin，且有骨質破壞的患者明顯高于無骨質破壞的患者（圖1）。

圖1 對照組及部分MM患者BMMNC中sclerostin的表達

2.2 sclerostin的水平與臨床參數的相關性分析 根據Greipp提供的MM預后相關參數，用Pearson相關分析方法分析β2－微球蛋白（β2－microglobulin，β2－MG）、肌酐（serum creatinine，Scr）、年齡（age）、血小板（platelet，PLT）、乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）、血紅蛋白（haemoglobin，Hb）、血清清蛋白（seralbumin，Alb）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、M蛋白的比例（輕鏈型、IgD和IgE型除外）、校正血鈣與sclerostin的相關性；用Spearman相關方法分析sclerostin與骨病分級及臨床ISS分期的相關性。結果顯示β2－MG、校正血鈣、ALP、M蛋白的比例、骨質損害評分和ISS分期與sclerostin均顯著相關（P≤0.05），見表1。

表1 sclerostin與MM患者主要臨床指標的相關性（±s）

表1 sclerostin與MM患者主要臨床指標的相關性（±s）

63.04±6.29 0.142 0.309 β2－MG（g／L） 5.98±2.26 0.704 0.000 Scr（μmol／L） 171.65±117.57 0.236 0.088 LDH（U／L） 309.03±115.57 0.259 0.061 ALB（g／L） 31.34±4.57 －0.108 0.440 ALP（U／L） 44.20±22.26 －0.379 0.005 PLT（109／L） 94.85±65.87 －0.250 0.071 Hb（g／L） 64.12±10.51 －0.256 0.064校正血鈣（mmol／L） 2.50±0.45 0.369 0.007 M蛋白的比例（%） 0.38±0.15 0.312 0.023 MBD 2（1，3） 0.410 0.002 ISS 3（1，3）r P年齡（歲）項目±s或 M（min，max）0.486 0.000

2.3 sclerostin對患者中位生存期的影響 本研究中位隨訪時間29（6～65）個月，其中總體生存期大于或等于5年者3例（5.56%），大于或等于3年者21例（39.62%），大于或等于1年者48例（90.57%）。死亡15例（28.30%），1～3年內死亡10例，3～5年內死亡2例，5年以上死亡3例。4例死于復發或骨髓瘤未緩解；1例轉為漿細胞白血病；2例死于心腦血管疾病；2例死于腎衰竭；6例死于化療后骨髓抑制的嚴重并發癥如重癥感染、出血。根據對照組的sclerostin水平，將sclerostin≤0.43pg／mL定為低sclerostin組，高于0.43pg／mL定為高sclerostin組。在低sclerostin組中，19例患者在隨訪期間共14例生存，中位生存期為48（6～65）個月，95%CI 33.24～62.76；高sclerostin組中，34例患者在隨訪期間共24例生存，中位生存期為24（6～52）個月，95%CI15.43～32.57。經Kaplan－Meier生存曲線分析兩組中位生存期，差異有統計學意義（χ2＝12.74，P＜0.01）。

3 討 論

sclerostin是SOST基因的表達產物，是一種含胱氨酸結構的分泌型糖蛋白，是骨細胞分泌的成骨細胞的負調控因子，參與調節骨形成，決定骨重建過程中的骨量和結構［7］。目前國內關于sclerostin的研究主要集中在骨質疏松領域中，在骨髓瘤或其他惡性腫瘤導致的骨質破壞中少見報道，國外學者發現MM患者外周血sclerostin水平較健康人高，其骨質破壞嚴重的患者顯著高于骨質破壞不明顯、意義未明的單克隆球蛋白增多癥的患者［8］。這暗示sclerostin在 MBD的發生、發展中可能起重要作用。本研究以骨髓為樣本，研究sclerostin在MM患者骨髓中的表達及臨床意義。

本研究發現，MM患者骨髓上清液中的sclerostin水平高于對照組，且復發難治的MM患者明顯高于初診患者及對照組。這說明MM患者骨髓細胞可能表達sclerostin，本研究還從分子水平進一步證實大部分MM患者表達sclerostin，有骨質破壞的患者表達陽性強于無骨質破壞的患者，且骨質破壞越明顯，其sclerostin的表達陽性越明顯。但表達sclerostin的BMMNC是骨髓瘤細胞還是骨髓基質細胞則有待進一步研究。復發難治的MM患者對化療藥物不敏感，瘤負荷高，瘤細胞與骨髓基質細胞黏附后分泌多種炎癥因子導致瘤細胞或骨髓基質細胞持續表達更多的sclerostin。

本研究發現sclerostin與β2－MG、Ca2＋、ALP、M 蛋白的比例、骨質損害評分和ISS分期均相關。ALP主要是由成骨細胞產生，ALP與sclerostin呈負相關，這與Brunetti等［8］的研究一致，說明sclerostin可能會抑制成骨細胞的活性，其機制可能是sclerostin阻止Wnt蛋白結合于卷曲蛋白1～10和低密度脂蛋白受體相關蛋白5／6，抑制β－鏈蛋白進入細胞質。從而阻抑Wnt經典信號通路，抑制了前體成骨細胞的生長和早期階段的分化，導致OB數量下降，ALP的活性下降［9－10］。

校正血鈣、骨質損害評分主要是反映骨質破壞情況，他們與sclerostin有明顯的正相關。這說明sclerostin能反映骨質破壞情況，在MM中可能導致MBD，其具體機制目前不明，可能與巨噬細胞炎癥蛋白1－α相關［11］。也可能通過抑制Wnt經典及非經典信號途徑，導致細胞外基質成熟障礙、細胞外基質礦化降低及骨量減少［12－13］，從而導致 MBD的發生。Brunetti等［8］發現MM患者外周血sclerostin與β2－MG呈正相關，本研究不僅驗證這一點，還發現sclerostin與M蛋白的比例和ISS分期呈正相關。β2－MG、M蛋白、ISS臨床分期能較好地反映體內瘤負荷水平，這說明sclerostin也能較好地反映瘤負荷及預后，是疾病預后不良的一項指標。其機制可能是sclerostin在抑制骨髓基質細胞向OB分化成熟的同時，導致白細胞介素－6及其他促進MM細胞生長的因子生成增多［14］，瘤負荷增高；也可能是sclerostin通過抑制骨髄修復而促進腫瘤細胞的生長［15］。

本研究還發現，低sclerostin組患者中位生存期均高于高sclerostin組患者。本研究因樣本數較少，采用為對照組x±2s為分界點，發現sclerostin大于0.43pg／mL是MM患者預后不良的一個指標。這說明sclerostin能較好地預測MM患者的生存期。其原因可能是該類患者存在較嚴重的骨質破壞如壓縮性骨折或病理性骨質，需較長時間的臥床，機體的免疫功能差，容易并發肺部等臟器感染，并發癥多；也可能是高水平sclerostin在抑制Wnt經典信號通路的過程中，白細胞介素－6等促進瘤細胞增殖的因子增多［15］，瘤負荷高，耐藥性增強，對藥物敏感性差，緩解率及中位生存期低。

綜上所述，sclerostin在MM患者骨髓上清液中的水平增高，其水平能反映MM患者骨質破壞、成骨受抑的程度及機體瘤負荷的水平，并能在一定程度反映患者的中位生存期，其增高機制還有待研究，為進一步治療MM提供了新的治療靶點。

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