米曲霉Y6產中性蛋白酶和內切葡聚糖酶的研究

周雄川，李冬生，陳 雄*，王 志

（湖北工業大學 生物工程學院，發酵工程教育部重點實驗室，工業發酵湖北省協同創新中心，湖北 武漢 430068）

醬油釀造中制曲菌株主要是米曲霉（Aspergillusoryzae），而米曲霉的主要酶系為蛋白酶和淀粉酶，并且這2種酶的酶活較高[1]；另有纖維素降解酶[1-2]和谷氨酰胺酶。醬油釀造過程中主要用到的原料是大豆、豆粕、麩皮和面粉，其中豆粕蛋白質含量高，脂肪含量低，水分也少，容易粉碎，價格低廉，是醬油釀造的理想原料[3-4]。麩皮是小麥制粉時的副產品，麩皮質地疏松，表面積大，但比重小，且含粗蛋白質9.4%～17.5%，粗脂肪1.7%～5.6%，還含有多種維生素及鈣、鐵等無機鹽，營養成分適于促進米曲霉生長及其產酶[5]。醬油釀造需極強的蛋白酶活力，為使大豆蛋白酶從組織中充分裸露，又需借助植物崩裂酶活力（果膠酶、半纖維素酶、纖維素酶等）[6]。蛋白酶包括酸性蛋白酶，中性蛋白酶和堿性蛋白酶，其中中性蛋白酶酶活較高[7-8]。纖維素降解酶是一個多組分酶系，通常包括內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶[9-11]。內切葡聚糖酶作用于纖維素分子內部的非晶體區或羧甲基纖維素，隨機水解β-1，4-糖苷鍵，將長鏈纖維分子截斷，產生大量小分子纖維素，因此，內切葡聚糖酶是提高醬油的膳食纖維含量的一個關鍵酶。內切葡聚糖酶可以降解大分子不溶性膳食纖維為可溶性膳食纖維，提高醬油中可溶性膳食纖維的含量，因此，提高米曲霉在制曲過程中蛋白酶和內切葡聚糖酶的活力對于醬油釀造具有十分重要的意義。

本研究以提高米曲霉Y6菌株產中性蛋白酶和內切葡聚糖酶的活力為目的，以豆粕和麩皮為原料，通過單因素試驗和正交試驗來確定最佳發酵工藝條件，為高膳食纖維風味醬油釀造制曲工藝的改進提供實驗基礎和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

米曲霉（Aspergillus oryzae）Y6，為本實驗室保藏。

1.1.2 培養基

固體培養基：豆粕和麩皮質量比為7∶3再加一定量的水。

1.1.3 化學試劑

干酪素（化學純）：北京鼎生物技術有限責任公司；Folin-酚、三氯乙酸、碳酸鈉、羧甲基纖維素鈉：國藥集團化學試劑有限公司；3，5-二硝基水楊酸：武漢市華順生物有限公司。

1.2 儀器與設備

AL204電子天平：奧豪斯國際貿易（上海）有限公司；LRH-250生化恒溫培養箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；722型-分光光度計：上海精密儀器有限公司；HS30A恒溫水浴搖床：中國科學院武漢科學儀器廠；JXY4-H8數顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶活的定義

中性蛋白酶活的定義：1g固態發酵產物在40℃、pH 7.2條件下，1min分解酪蛋白產生1μg酪氨酸，定義為一個酶活單位，U/g。

內切葡聚糖酶活的定義：1g固態發酵產物在40℃、pH 5.5條件下，1min分解羧甲基纖維素鈉產生1μg葡萄糖，定義為一個酶活單位，U/g。

1.3.2 酶活的測定方法

中性蛋白酶酶活采用福林-酚方法測定[12]。內切葡聚糖酶活按參考文獻[13]的方法測定。

1.3.3 米曲霉工藝優化試驗

利用單因素試驗，在不同溫度、接種量、含水量和發酵時間的工藝條件下，對米曲霉Y6產中性蛋白酶、內切葡聚糖酶的活力進行檢測，初步確定菌株產酶較適合的溫度、接種量、含水量和發酵時間。在此基礎上，利用L9（34）正交試驗設計確定米曲霉Y6最佳制曲工藝。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 不同接種量對酶活力的影響

接種量對微生物生長的延遲期有一定的影響，一般來講，接種量越大，延遲期越短，有利于微生物生長和代謝產物積累[14]，但米曲霉產酶部位是菌絲，接種量太多不利于米曲霉的菌絲的生長，也不利于產酶。

圖1 接種量對中性蛋白酶活力的影響Fig.1 Effect of inoculum on neutral protease activity

由圖1可知，接種量對米曲霉產酶有一定影響，接種量為1.0×107個孢子/g干基時，中性蛋白酶活力最高，其達到2837U/g；接種量為0.5×107個孢子/g干基時，中性蛋白酶活力為2635U/g；接種量分別為1.5×107個孢子/g干基和2.0×107個孢子/g干基時，中性蛋白酶活力分別達到2348U/g和2174U/g。因此，中性蛋白酶的最佳接種量為1.0×107個孢子/g干基。

圖2 接種量對內切葡聚糖酶活力的影響Fig.2 Effect of inoculum on endoglucanase activity

由圖2可知，接種量為0.25×107個孢子/g干基時，內切葡聚糖酶的酶活為658U/g；接種量為0.5×107個孢子/g干基時，內切葡聚糖酶活力最高，其為683U/g；當接種量分別增加到0.75×107個孢子/g干基和1.0×107個孢子/g干基時，內切葡聚糖酶活力分別下降為623U/g和602U/g，因此，內切葡聚糖酶的最佳接種量為0.5×107個孢子/g干基。

2.1.2 不同溫度對酶活力的影響

溫度是微生物生長和代謝的重要條件，溫度也是保證米曲霉產酶的重要條件。溫度過低或過高都不利于菌體的生長和產酶。因此，在發酵過程中必須保證合適而穩定的溫度環境[15]。

圖3 溫度對中性蛋白酶活力的影響Fig.3 Effect of temperature on neutral protease activity

由圖3可知，中性蛋白酶的最適發酵溫度為30℃時，蛋白酶活力最高，達到了3051U/g，溫度高于32℃或低于28℃米曲霉的中性蛋白酶活力都會下降。

由圖4可知，在30℃時，米曲霉Y6發酵產物的內切葡聚糖酶活力為703U/g，隨著溫度升高為32℃時，內切葡聚糖酶的活力下降到674U/g，而溫度降低為28℃時內切葡聚糖酶的活力僅為613U/g。因此，內切葡聚糖酶的最適發酵溫度為30℃。

圖4 溫度對內切葡聚糖酶活力的影響Fig.4 Effect of temperature on endoglucanase activity

2.1.3 不同含水量對酶活力的影響

固體發酵培養基的含水量在整個發酵過程中起關鍵性作用。一方面，含水量影響到微生物生長所要求的滲透壓；另一方面，含水量對微生物生長和產酶的影響還由于其可改變固體顆粒的物理性質，過高的含水量會改變豆粕和麩皮顆粒之間的松散性，使豆粕和麩皮成團，影響到氧氣的傳遞和發酵熱的散失，導致酶活力下降，而含水量過低則會影響到營養物質的溶解和傳遞以及顆粒的潤脹等條件，限制微生物對營養物質的利用[16]。

圖5 含水量對中性蛋白酶活力的影響Fig.5 Effect of moisture on neutral protease activity

由圖5可知，含水量為70%時，中性蛋白酶的活力為2831U/g；含水量為80%時，酶活為3236U/g；隨著含水量分別增加至90%和100%，中性蛋白酶活力分別下降至2748U/g和2457U/g。因此，可以得出中性蛋白酶最佳發酵的含水量為80%。

由圖6可知，含水量對內切葡聚糖酶的活力有比較大的影響，在一定的范圍里，隨著含水量的不斷增加，內切葡聚糖酶的活力在不斷增加，在含水量為80%時，內切葡聚糖酶的活力為447U/g；當含水量上升為100%時，內切葡聚糖酶的活力為736U/g，增加了64.7%；但當含水量繼續增加為110%，內切葡聚糖酶的酶活又降低至652U/g，因此內切葡聚糖酶的最佳發酵含水量為100%。

圖6 含水量對內切葡聚糖酶活力的影響Fig.6 Effect of moisture on endoglucanase activity

2.1.4 不同培養時間對酶活力的影響

培養時間對于米曲霉產酶有比較大的影響，米曲霉的孢子在營養充足的條件下發芽繁殖生成菌絲體，米曲霉的各種酶系是由菌絲體代謝產生，因此，在這個時期米曲霉的產酶能力很強，而隨著時間的延續，米曲霉繁殖到一定的程度后，由于溫度、濕度、營養物質的限制，米曲霉的菌絲又開始產生孢子，這個時期又不利于產酶。

圖7 培養時間對中性蛋白酶活力的影響Fig.7 Effect of culture time on neutral protease activity

由圖7可知，米曲霉在不同的培養時間段中性蛋白酶活力存在明顯的差異，在36h時酶活最低，只有2369U/g，而在42h時酶活到達最高，為3252U/g，48h和54h時的酶活分別為2754U/g和2538U/g，因此，米曲霉產中性蛋白酶的最佳時間為42h。

圖8 培養時間對內切葡聚糖酶活力的影響Fig.8 Effect of culture time on endoglucanase activity

由圖8可知，不同的培養時間對米曲霉產內切葡聚糖酶有比較顯著的影響，在一定的范圍里，隨著時間的延長，內切葡聚糖酶活力不斷增加，在36h的酶活為512U/g，48h時的酶活為646U/g，60h的酶活為740U/g，但當培養時間繼續延長為72h時，酶活又下降到652U/g，因此，米曲霉產內切葡聚糖解酶的最佳時間為60h。

2.2 發酵條件優化正交試驗結果

依據單因素試驗和醬油的釀造工藝條件，選擇溫度、接種量、培養時間和含水量4個因素，按表1和表2所示因素水平，在豆粕和麩皮培養基中進行固態發酵實驗，以發酵產物中的中性蛋白酶，內切葡聚糖酶的活力為評價指標來確定最佳發酵條件，正交試驗結果分別見表3及表4。

表1 米曲霉產中性蛋白酶發酵條件優化正交試驗與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for optimization of neutral protease production byAspergillus oryzae

表2 米曲霉產內切葡聚糖酶發酵條件優化正交試驗與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for optimization of endoglucanase production byAspergillus oryzae

表3 米曲霉產中性蛋白酶發酵條件優化正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonalexperiments for optimization of neutral protease production byAspergillus oryzae

由表3可知，培養時間對固態發酵產物中的中性蛋白酶的酶活影響最大，其次為接種量，溫度的影響最小。菌株最佳發酵參數為2號組合（A2B2C2D2），即溫度為28℃，接種量1.0×107個孢子/g干基，培養時間42h，含水量80%，在此條件下，中性蛋白酶活力達到3254U/g。由極差分析得到的菌株最佳發酵參數組合為A2B2C2D2，由于試驗得到的最優發酵條件未包含在正交試驗設計表的9組試驗中，為進一步確定實驗結果，按溫度30℃，接種量1.0×107個孢子/g干基，培養時間42h，含水量80%，做了3次平行試驗，中性蛋白酶酶活平均值為3637U/g，因此得到米曲霉產中性蛋白酶的最佳發酵工藝為溫度30℃，接種量1.0×107個孢子/g干基，培養時間42h，含水量80%。

表4 米曲霉產內切葡聚糖酶發酵條件優化正交試驗結果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonalexperiments for optimization of endoglucanase production byAspergillus oryzae

由表4可知，含水量對固態發酵產物中內切葡聚糖酶的酶活影響最大，其次為培養時間，溫度的影響最小。菌株最佳發酵參數為4號組合（E2F1G2H3），即溫度為30℃，接種量0.25×107個孢子/g干基，培養時間48h，含水量110%，在此條件下，內切葡聚糖酶活力達到734U/g。由極差分析得到的菌株最佳發酵參數為E2F1G2H2，由試驗得到的最優發酵條件未包含在正交試驗設計表的9組試驗中，為進一步確定試驗結果，按溫度30℃，接種量0.25×107個孢子/g干基，培養時間48h，含水量100%，做了3次平行試驗，內切葡聚糖酶酶活平均值為810U/g，因此得到米曲霉產內切葡聚糖酶的最佳發酵工藝為溫度為30℃，接種量0.25×107個孢子/g干基，培養時間48h，含水量100%。

3 結論

對米曲霉菌株以豆粕和麩皮為培養基的制曲工藝進行了研究，正交試驗結果顯示米曲霉產中性蛋白酶的最佳制曲工藝為溫度30℃，接種量1.0×107個孢子/g干基，培養時間42h，含水量80%，而產內切葡聚糖酶的最佳制曲工藝為溫度為30℃，接種量0.25×107個孢子/g干基，培養時間48h，含水量100%。該制曲工藝可以用來指導高膳食纖維風味醬油的釀造，在高膳食纖維醬油釀造制曲過程中可以適當的控制蛋白酶活力不降低的情況下來提高內切葡聚糖酶的活力，從而可以提高醬油中膳食纖維含量。

綜上所述，米曲霉Y6能產多種酶類，對于提高醬油的原料的利用率以及提高醬油的可溶性膳食纖維含量具有十分重要的作用。

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