結核分枝桿菌與兩種人工關節介面黏附特點對比研究①

包二平，黃迅悟，李洪敏，馮會成，董志明

髖膝關節結核在全身骨結核中約占30%，僅次于脊柱結核而居第二位[1]。晚期髖膝關節結核導致嚴重關節缺損，通常采用一期或二期人工關節置換重建關節功能，但術后結核復發問題尚未解決。結核復發受多種因素影響，包括患者的免疫功能、抗結核化療、感染結核菌是否耐藥、人工假體選擇等。本研究通過體外實驗觀察結核分枝桿菌與兩種不同人工材料表面的黏附情況，為臨床選擇人工關節假體提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 結核分枝桿菌 結核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)標準株H37Rv，北京結核病防治所提供。

1.1.2 培養基 BACTEC MGIT 960(M960)液體培養基，北京解放軍309醫院結核臨床實驗室提供，將40個培養基進行編號。

1.1.3 人工關節介面材料 將鈷鉻鉬合金(Chromium-Cobalt-Alloy，北京航空航天設計院提供)，制成直徑5 mm、厚1.6 mm圓柱體，按照人工關節表面處理工藝，圓柱形實驗材料表面分別做成多孔涂層和羥基磷灰石涂層。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗材料與結核分枝桿菌共同培養 將表面多孔涂層和羥基磷灰石涂層兩組表面性狀不同的實驗材料每組各取20片，用蒸餾水超聲波震蕩洗滌后，高溫消毒。在無菌條件下用4號線固定并且懸吊于M960培養基中，每個培養基放一個樣本。同時將MTB用生理鹽水稀釋濃度約為1×1011CFU/L(CFU：集落形成單位)的細菌懸液。每個M960培養基分別加結核菌液0.5 ml，完畢后放置M960培養儀中，37℃下震蕩培養。

1.2.2 結核分枝桿菌生長情況測定 將結核分枝桿菌與實驗材料共同培養28 d，每7天從培養兩種實驗材料的M960培養基分別各取0.1 ml菌液。用721分光光度計(波長590 nm、光鏡1.0 cm、蒸餾水調零)測定M960培養基中OD值[2]。

1.2.3 掃描電鏡觀察 將實驗材料從液體培養基中取出，用生理鹽水10 ml沖洗3遍以除去表面未黏附的結核分枝桿菌，置入3%戊二醛中固定4 h后，梯度酒精(50%、70%、80%、90%)脫水，室溫下干燥，IB-5型重離子濺射儀表面噴金，PHILIP ESEM 30掃描電鏡下觀察結核分枝桿菌在材料表面的黏附情況。每塊材料隨機選取10個視野，計算每個視野結核分枝桿菌總數。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 結核分枝桿菌生長情況

不同時間點，結核分枝桿菌在兩種材料表面的OD值均無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

表1 結核分枝桿菌在兩種材料表面培養不同時間后的OD值

2.2 電鏡觀察結果

培養第28天結核桿菌掃描電鏡所見(圖1)，多孔涂層組結核分枝桿菌黏附量明顯多于羥基磷灰石涂層組(P＜0.01)。見表2。

表2 培養第28天結核分枝桿菌與兩種材料的平均黏附數量(個/視野)

圖1 結核分枝桿菌生長28 d對兩種材料的黏附情況(掃描電鏡，10000×)

3 討論

生物材料植入術后感染是從細菌與生物材料黏附開始[3]。黏附在材料表面的細菌不斷繁殖，產生較多的細胞外黏滯物，與細胞外基質蛋白如纖維蛋白原等共同形成一層包繞材料的生物膜。生物膜為細菌黏附提供新的位點，加速其黏附，同時保護細菌免受藥物殺滅及機體的免疫攻擊，常規保守治療很難奏效，往往不得不取出內植在關節中的內固定物，導致手術失敗。

細菌黏附受生物材料表面理化性能的影響較大，如表面化學組成、表面自由能(包括修復材料的表面自由能、細菌的表面自由能及懸浮介質的表面張力)、表面親水性/疏水性、表面粗糙度[4]及其布朗運動和范德華力等物理力作用。因此，通過改變種植體表面的物理性能，控制致病菌黏附和聚集，減少種植體周圍組織病變，從而提高種植體植入成功率[5-6]。由于人工假體表面處理技術不同、光澤度、孔隙度不同，結核分枝桿菌對不同假體介面黏附力是否存在差異尚無文獻報道。

由于結核分枝桿菌屬于慢生長菌，周期為24～36 h，比普通細菌傳代時長約60倍[7]。結核分枝桿菌無菌毛、鞭毛、莢膜等黏附“配體”，活動力差，對各種材料表面黏附力較弱。王鵬祥等報道結核分枝與表皮葡萄球菌對鈦及鈦合金材料表面的黏附力是不同的[8]。結核分枝桿菌在機體內對生物材料的黏附是由多種蛋白質共同協作的復雜生物過程，在這個過程中主要依靠特有的黏附素。國內外對結核分枝桿菌的研究表明黏附素在結核分枝桿菌入侵、發病及播散方面有重要作用[9]，也是結核分枝桿菌與生物材料黏附的主要黏附物[10-11]。黏附素由結核分枝桿菌自身分泌[12]，由多種蛋白構成，包括磷酸酰基醇甘露糖苷(PIM)、肝素結合血凝集黏附素(HBHA)、纖維結合蛋白(FAP)、和層粘連蛋白(LN)等。

本研究將人工假體材料植入結核菌液中共同培養28 d，兩種材料對結核分枝桿菌生長無明顯影響(P＞0.05)。結核分枝桿菌在多孔介面黏附量高于羥基磷灰石涂層介面(P＜0.05)。這種差異可能與兩種假體介面結構、物理特性、接觸角和表面能等因素影響有關。

本實驗結果表明，結核分枝桿菌與人工關節假體介面有黏附力。結核分枝桿菌與多孔和羥基磷灰石涂層人工關節界面黏附有差異，關節結核患者人工關節置換，選擇羥基磷灰石涂層比多孔涂層更有優勢。由于我們所選取材料的表面處理與臨床使用假體一致，使實驗結果對關節結核患者人工假體選擇提供一定參考。

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