雞肉空腸彎曲桿菌的污染率與耐藥性分析

陳櫟娜，陸思琴，陳 荀，劉書亮

（四川農業大學食品學院，四川 雅安625014）

空腸彎曲桿菌是一種主要的食源性病原菌，是引起全世界人類細菌性腹瀉的主要原因［1］，可引起人的急性腸炎和食物中毒，并伴有反應性關節炎、格林－巴利綜合征等免疫性疾?。?］。近年來，畜禽養殖業快速發展，大量抗生素被應用到生產中，導致該菌的耐藥性顯著增加。關于空腸彎曲桿菌耐藥性的研究，主要在養殖場畜禽源，對于食源性菌株耐藥性的研究較少。本試驗對四川省雅安市市售雞肉進行了調查，研究了其中空腸彎曲桿菌的污染率及耐藥性。

1 材料與方法

1．1 樣品 從雅安市定點屠宰場分4次共采集雞胸肉、雞翅、雞肝樣品共183份。

1．2 質控菌株 空腸彎曲桿菌（C．jejuni）ATCC－33560。

1．3 藥品試劑 （1）培養基試劑：標準新生級牛血清，脫纖維羊血。（2）培養基：改良Skirrow氏瓊脂基礎，CCDA瓊脂基礎，布氏肉湯，哥倫比亞血瓊脂基礎，M－H 培養基；Cary－Blair運送培養基，Skirrow瓊脂，哥倫比亞瓊脂。（3）抗生素：紅霉素（Erythromycin，EM），克林霉素（Clindamycin，CLI），環丙沙星（Ciprofloxacin，CIP），左氟沙星（Levofloxacin，LEV），鏈霉素（Streptomycin，STR），慶大霉素（Gentamicin，GEN），四環素（Tetracycline，TET），氟苯尼考（Florfenicol，FLO）。

1．4 主要儀器 CO2培養箱；微量移液器；顯微鏡；顯微成像系統；超純水系統。

1．5 樣品的采集及運送 按 GB／T 4789．9－2003要求對雞肉、雞肝樣品進行采樣。

1．6 菌株的分離純化 按張曉利［3］等創建的組合生化法進行增菌培養及分離純化。

1．7 菌種鑒定

1．7．1 初步鑒定 根據菌落生長特征、革蘭染色特征、氧化酶試驗和過氧化氫酶試驗結果，按GB／T 4789．9－2003進行。

1．7．2 二重PCR鑒定 （1）引物設計：針對彎曲菌屬16SrRNA基因的引物（16S－F和16S－R，序列為5′－gcgaagaacctaccyggrcttgata－3′ 和 5′－tcgcgrtattgcgtctcattgtatatg－3′，產物大小314bp）和空腸彎曲菌hipO 基因的引物（HIP－F 和 HIP－R，序列 5′－gatctgcaaaattagtggcg－3′為 5′－gcaaaggcaaagcatccat－3′，產物大小149bp），進行設計。（2）PCR模板制備：挑取哥倫比亞血瓊脂培養基上的菌落于布氏肉湯中培養48h，用熱裂解法提取空腸彎曲桿菌DNA，將模板DNA置于－20℃備用。（3）PCR擴增：PCR 反應體系：10× PCR Buffer 2．5μL、25 mmol／L MgCl21．5μL、dNTP mixture 2μL、模板1 μL、10μmol／L引物各0．5μL、Taq聚合酶0．5μL，補水至25μL。循環參數：（95℃，5min）＋［（95℃，35s）＋ （56．5℃，40s）＋ （72℃，45s）］×35＋（72℃，7min）。（4）PCR 產物的鑒定及分析：用0．5×TBE電泳緩沖液配制1．0%瓊脂糖凝膠溶液，100V電泳40min，于凝膠成像系統中拍攝分析電泳結果。（5）PCR鑒定為空腸彎曲桿菌的菌種進行凍干保存，備用。

1．8 藥敏試驗

1．8．1 配制 按CLSI規定進行藥液配制［4］，將藥物溶解，制成濃度為5 120μg／mL或2 560μg／mL的儲藏液，于－20℃冰箱保存。使用前稀釋到所需濃度。

1．8．2 試驗 （1）藥敏盒的制備：在無菌96孔板的各孔加入含10%新生牛血清的 M－H肉湯液100 μL，第一孔加入100μL藥物，梯度稀釋至最后一列，最后一孔吸取100μL混合液棄去。（2）接種和觀察結果：將M－H肉湯培養48h的菌液稀釋至0．5麥氏比濁管，用M－H肉湯稀釋100倍。取100μL接種于藥敏試劑盒，37℃微好氧條件下培養42h。加入0．5%TTC試劑1～2滴，培養30min，觀察結果，以空腸彎曲桿菌標菌為質控菌株，符合最低抑菌濃度（Minimum Inhibition Concentration，MIC）標準則判定菌株耐藥［5］。

2 結果與分析

2．1 初步鑒定 從183份雞肉中初步分離得到36株疑似菌株。在哥倫比亞血培養基上的菌落特征為不溶血、扁平、灰色不反光、半透明、白色、棕黃色凸起、邊緣不整齊、有時沿接種線向外擴散的典型菌落，在CCDA培養基上為灰白、濕潤的菌落。經涂片作革蘭染色鏡檢為革蘭陰性菌，如小逗點狀，兩菌體的末端相連時，呈S形、海鷗形或螺旋狀。其過氧化氫酶試驗均呈陽性、氧化酶試驗均呈陽性，可初步判定為C．jejuni。

2．2 二重PCR鑒定 電泳結果表明（圖1），從C．jejuni標準株中擴增出兩個長約314bp和149bp的特異片段。根據所選擇的兩對特異性PCR引物對分離的36株疑似菌株進行二重PCR檢測，其中25株C．jejuni能同時擴增出兩條目的條帶，其余菌株擴增出一條。綜上可知，本試驗從183份雞肉樣品中分離得到25株C．jejuni，污染率為13．66%。

2．3 藥敏試驗 肉湯微量稀釋法測定分離菌株對常見抗菌藥物的敏感性如表3所示，所有菌株對CIP、LEV耐受，對CLI、TET耐藥率較高，所有菌株對FLO，GEN敏感（表2）。88%的菌株顯示出多重耐藥性（表3）。

圖1 雞肉中空腸彎曲桿菌PCR擴增產物的電泳圖

表2 雞肉中空腸彎曲桿菌分離株（25株）對8種藥物的耐藥率 （%）

表3 雞肉空腸彎曲桿菌耐藥譜

3 討論與結論

本試驗采用常規分離與二重PCR鑒定結合，從183份雞肉樣品中鑒定出C．jejuni25株，高于其他報道［3、6］，結果表明，調查的雞肉C．jejuni污染較嚴重，對消費者有潛在威脅。

獸藥在養殖業被廣泛使用，導致C．jejuni的耐藥性顯著增加，使該菌的耐藥性問題日益突出。試驗結果顯示，分離菌株對CIP、LEV耐藥率達100%，對CLI、TET和EM 的耐藥菌株分別為96%、84%和4%，對FLO、GEN敏感。國內外研究表明C．jejuni對EM，CLI，CIP有不同程度耐藥性［7－8］，對 GEN 敏感。還有研究表明C．jejuni對CIP，TET 耐 藥 率 分別為 71．4%［9］，13．7%［8］，有30．6%的菌株顯示多重耐藥性［10］。試驗結果與以上研究比較，C．jejuni對CIP、LEV耐受性普遍較高，對CLI、TET的耐受率較之前研究報道明顯升高。雖然本試驗發現耐EM菌株較少，但仍需加強監控。試驗表明C．jejuni對FLO、GEN的敏感性與國外研究報道一致。多重耐藥性會阻礙C．jejuni病的防治，特別是在禽畜養殖行業中。本試驗中88%分離菌株顯示出多重耐藥性，需在相關行業嚴格規范，遵守休藥期規定，控制耐藥性的產生和擴散，以預防疾病的發生。建立C．jejuni的污染現狀和耐藥性的資料文庫，為國家對C．jejuni病的預警、預防和治療具有重要意義。

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