牛體內恥垢分枝桿菌噬菌體的分離與保存

蘇勝兵，高云航，孟慶峰，于 錄，馬紅霞，胡靜濤，徐鳳宇

（1．吉林農業大學動物科技學院，吉林 長春130118；2．吉林農業大學動物生產及產品質量安全教育部重點實驗室，吉林 長春130118；3．吉林大學人獸共患病研究所，吉林 長春130062）

噬菌體是寄生于細菌、支原體、螺旋體、放線菌以及藍細菌等中的病毒，亦稱細菌病毒，在自然界分布極廣。由于細菌對抗生素耐藥率的不斷升高，補充抗生素治療細菌性疾病方法的研究成為解決該問題的有效途徑之一［1］。其中，對噬菌體的研究成為近年來的熱點，而噬菌體的分離及特性是其應用的前提。目前的研究以從體外環境中分離的噬菌體居多，然而對動物機體，它們是外來物質，機體易對其產生抗性，不利于噬菌體作為治療制劑和藥物載體的開發。機體內源噬菌體可克服這一不足。故從動物體內分離對某宿主菌特異的噬菌體，對開發其作為診斷和治療制劑，甚至藥物載體都有重要意義。鑒于體內來源噬菌體的潛在價值及恥垢分枝桿菌作為分枝桿菌研究的模式菌種，本試驗從副結核感染陽性和陰性奶牛體內分離了恥垢分枝桿菌烈性噬菌體。

1 材料與方法

1．1 供試樣本 吉林省某奶牛場送檢456份奶牛血清樣品。血清學檢測呈副結核病陽性或陰性奶牛的唾液和鼻黏液棉拭子共34份。

1．2 供試菌種 恥垢分枝桿菌（Mycobacterium．smegmetismc2155）為吉林大學人獸共患病研究所于錄教授饋贈。

1．3 主要試驗材料 ELISA檢測所用溶液按參考文獻［2］配制；7H9培養基為BD公司產品，用其配制雙層培養基時上、下層分別加0．7%、1．5%瓊脂。

SM液（噬菌體保存液）：按參考文獻［3］配制；噬菌體保護劑：各種噬菌體保護劑的制備方法及編號如表1和表2。

表1 液體法保存噬菌體所用的保護劑

表2 凍干法保存噬菌體所用的保護劑

1．4 奶牛副結核病的ELISA檢測 依參考文獻［2］進行。

1．5 唾液和鼻黏液樣品的采集 用無菌棉簽分別采集12頭ELISA檢測呈副結核病陽性奶牛和5頭呈副結核病陰性奶牛的唾液和鼻黏液，放入滅菌的5mL離心管中，置于4℃冰箱中，次日進行噬菌體的分離。

1．6 噬菌體的分離 參照文獻［4］中方法進行，略有改動。向裝有棉拭子的5mL離心管中加入2 mL滅菌生理鹽水，于4℃冰箱中作用24h，取出棉拭子，將離心管內液體傾入100mL滅菌塑料瓶中，并向其中加入噬菌體提取劑36mL（pH值為9．4），其混合液恒溫37℃、恒速250r／min旋轉振蕩30 min，使提取劑與噬菌體充分接觸。9 000r／min離心30min。過濾取上清液，調節pH值到6．6。取9 mL上清液，向其中加入10mL 2倍濃縮的7H9液體培養基、1mL恥垢分枝桿菌72h培養液、2mol／L氯化鈣10μL，37℃、150r／min振蕩培養48h。靜置30min，調節pH 值到9．4，4℃條件下10 000 r／min離心30min，0．22μm微孔濾膜過濾，取上清液，調節pH值至7．3，作為噬菌體原液，用雙層平板法檢測噬菌體。

1．7 噬菌體的純化 取培養72h的恥垢分枝桿菌菌液0．5mL，與噬菌體原液0．1mL混勻，室溫放置15min，加入5mL 50℃的半固體培養基，混勻后立即倒入下層瓊脂平板，制成雙層平板，待瓊脂凝固后，37℃倒置培養36h后，觀察噬菌斑的形態。

用滅菌牙簽挑取形態大小一致、單個獨立的典型噬菌斑，置于盛有1mL噬菌體保存液的無菌EP管中，室溫放置1h后4℃過夜，次日經旋渦振蕩器振蕩數秒后取0．1mL經過適當稀釋后，與恥垢分枝桿菌72h培養液做雙層平板進行純化。重復此步驟3～5次，直至觀察到的噬菌斑大小和形態均勻一致，得到純化的噬菌體原種。

1．8 噬菌體的電鏡觀察 取適當稀釋的純化噬菌體，經雙層平板培養使噬菌斑形成網狀后，加入SM液，4℃振蕩過夜，洗下噬菌體，11 000r／min離心30 min，取上清液過濾，用2%磷鎢酸染色1．5min后，透射電鏡觀察噬菌體形態、大小。

1．9 噬菌體的保存方法比較 從已經純化好的噬菌體中，選擇Y028T作為保存試驗的研究對象。

取20mL7H9培養基，向其中加入1mL恥垢分枝桿菌72h培養液和1mL噬菌體原液，擴增48 h，10 000r／min離心，用0．22μm微孔濾膜過濾，取上清，作為噬菌體保存原液（效價為2．5×107PFU／mL）。

將900μL各種噬菌體保護劑分別與100μL噬菌體保存原液混勻。液體保存組于4℃保存。凍干保護組平均分成兩組，凍干后分別于4℃和－70℃保存，每隔30d分別取一管用雙層瓊脂培養法測定效價，測定6次。

2 結果

2．1 副結核病ELISA檢測結果 送檢的456份血清樣品中，共檢出副結核陽性樣本12個。

2．2 噬菌體分離結果 采用雙層平板法驗證發現，恥垢分枝桿菌被侵染，出現大量噬菌斑（圖1），呈蠶蝕狀，推測樣品中含有能裂解恥垢分枝桿菌的噬菌體。

圖1 用雙層平板法鑒定恥垢分枝桿菌烈性噬菌體

2．3 噬菌體的純化 采用雙層平板法反復純化，直至得到的噬菌斑形態、大小均一，結果從34份樣品中分離到4株噬菌體，依據奶牛編號分別命名為Y028T 、Y010T、Y137T 、162B（圖2）。

2．4 噬菌體形態、大小 透射電鏡下觀察噬菌體的形態，發現所有分離毒株均有一個20面體對稱的頭部，有尾，有可收縮的尾鞘（圖3）。具體大小見表3。

圖2 純化后的Y028T（A）、Y010T（B）、Y137T（C）、162B（D）

圖3 電鏡下的Y028T（E）、Y010T（F）、Y137T（G）、162B（H）

表3 電鏡下噬菌體的大小

2．5 噬菌體的保存 采用不同保護劑在不同條件下保存Y028T，試驗結果為：8種液體保護劑中除SM液外，4℃保存的噬菌體效價均可在半年之內維持較高水平；真空凍干后－70℃保存的效果優于4℃。不同保護劑的保存效果相差較大，其中10%脫脂奶粉凍干后4℃或－70℃保存時，半年內效價僅在4℃保存時下降10倍，說明脫脂奶粉是凍干保存Y028T的最佳保護劑。

3 討論

3．1 噬菌體的分離 筆者在分離噬菌體時注意到，宿主菌與待分離樣品混合后增殖時，氣浴恒溫振蕩器轉數應適宜，因為該操作會影響噬菌體對宿主菌的吸附。本試驗采用150r／min，效果較好。然而不同噬菌體最適合的轉數也不盡相同，需不斷摸索確定。此外，噬菌體的分離率還有明顯的季節性，如果從動物體外的環境中分離，則在溫暖的季節，噬菌體的檢出率較高［5］。據Jamalludeen報道，從加拿大安大略省38個豬場污水分離大腸桿菌噬菌體時，6月份～8月份的分離率明顯高于4月份和5月份［6］。代保英在10月份、11月份于江蘇省揚州市采集了100多份樣品，只分離出3株噬菌體，其結果可說明天氣寒冷時噬菌體檢出率不高［7］。如果從動物體內分離噬菌體，作者認為分離率可能會依機體帶菌程度不同而有差異。

3．2 噬菌體的純化 噬菌體的純化一般采用雙層平板法，有的還須聯合液體增殖法［8］，本試驗僅采用了雙層平板法，因為挑取的單斑中噬菌體濃度已超過1．0×105PFU／mL。純化的次數通常為3～7次，具體次數依純化的噬菌斑形態是否一致而定。純化過程中，制備雙層平板前，要盡量滿足兩個條件：一是混勻宿主菌液、噬菌體液和半固體培養基；二是噬菌體液中含有的噬菌體數量不宜過多，最好控制在300 PFU／mL以下。

噬菌體的稀釋液也有幾種，PBS、SM液、細菌培養液都有報道［9－11］。本試驗曾用SM液，但效果不好，后改用不含OADC的7H9培養液，效果很好。

3．3 噬菌體的保存 本研究采用的低溫冷凍干燥法保存噬菌體為國際微生物保藏機構通用的方法之一，一般可維持微生物的活力達數年至10余年。研究結果以及關于分枝桿菌噬菌體D29、大腸桿菌O157噬菌體、綠膿桿菌噬菌體的保存研究都證明用10%脫脂奶粉做保護劑的有效性［3，12－13］。

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