鴨鏈球菌的分離鑒定及其16SrRNA基因序列分析

盧受昇，孔令辰，羅晶璐，張 翰，孫彥偉

（廣東省動物衛生監督總所，廣東 廣州510230）

鴨鏈球菌病是由鏈球菌引起的鴨的急性或慢性傳染病，雛鴨感染主要表現為急性死亡，一旦發病，可引起大量死亡。成年鴨和種鴨感染主要表現為跛行與癱瘓，死亡率一般較低，對生產性能產生較大的不良影響，造成經濟損失［1］。2011年6月，某鴨場先后引進雛鴨兩批，其中第1批4 000羽于7日齡發病，4d后，第2批4 000羽（3日齡）也開始發病，表現為拉稀，縮頭，精神差，腳軟，減食，其后出現死亡，立即使用氟苯尼考、硫酸新霉素等藥物進行治療，病情得到有效控制，全程兩批鴨共死亡100多只。現將診斷情況介紹如下，供讀者參考。

1 材料與方法

1．1 材料 病料：某肉鴨場10日齡病死雛鴨。

試驗動物：1日齡健康雛鴨，飼養觀察到5日齡。

主要儀器與試劑：營養瓊脂、血液瓊脂、麥康凱瓊脂培養基為廣州環凱微生物科技有限公司產品，在使用時自行配制；全自動微生物鑒定系統VITEK－32、GPI細菌生化鑒定卡、革蘭染色液、接觸酶試劑、氧化酶試劑均為法國梅里埃公司產品；藥敏試紙為杭州天和微生物試劑有限公司產品；PCR預混試劑Premix Ex、載體pMD18－T、DH5α感受態細胞均為寶生物工程（大連）有限公司產品；DNA回收試劑盒 Wizard SV Gel and PCR Clean－Up System為Promega公司產品。

1．2 方法

1．2．1 剖檢與細菌分離 常規方法對病死鴨進行剖檢。無菌操作采集肝臟、心血，接種于營養瓊脂、血液瓊脂、麥康凱瓊脂平板培養基，37℃培養24h。1．2．2 生化試驗 將細菌的純培養物，按試劑說明書進行氧化酶、觸酶試驗，再選用梅里埃細菌生化鑒定卡GPI在VITEK－32全自動微生物鑒定系統中進行鑒定。

1．2．3 藥敏試驗 紙片法，按試劑說明書進行。

1．2．4 動物試驗 用滅菌生理鹽水，將培養基中的菌落洗下（約2個麥氏比濁度），腿肌注射，接種5日齡雛鴨8只，每只0．5mL，對照組雛鴨8只，以同樣的方式和劑量接種生理鹽水。每天進行觀察，對死亡鴨只進行剖檢，并從肝臟和心血中分離細菌。

1．2．5 16SrRNA序列的測定 引物采用細菌16S rRNA 通用引物 F27：5′－AGAGTTTGATCMTGGCTCAG－3′，R1492：5′－TACGGYTACCTTGTTACGAC－TT－3′，擴增長度約為1 500bp，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。PCR擴增采用50μL體系，Premix EX 25μL、上下游引物各1μL、去離子水20μL、菌液3μL；反應程序為95℃30s，53℃30s，72℃90s，30個循環；72℃ 延伸8 min。產物電泳回收后，與載體pMD18－T連接，轉化到DH5α中，經克隆鑒定后送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。

2 結果

2．1 病理剖檢 剖檢病變主要為：全身充血、出血；肝臟腫大、充血出血；脾臟腫大，有灰白色壞死點；腎輕度出血，輸尿管有白色尿酸鹽沉積；跗關節稍腫大，關節液增多；腦膜下出血（見中插彩版圖1）。

2．2 細菌培養及染色特性 從肝臟、心血中分離到一種菌落形態較一致的細菌。營養瓊脂上菌落為灰白色細小菌落，生長很貧瘠；血液瓊脂上菌落為圓形、邊緣整齊、表面光滑、扁平隆起、淡白色的細小菌落，呈α溶血；麥康凱瓊脂上不生長（見中插彩版圖2）。取純培養物進行革蘭染色，結果為革蘭陽性球菌，呈單個、成對、短鏈狀或成堆排列（見圖3）。

圖3 革蘭染色結果

2．3 生化鑒定結果 氧化酶試驗為陰性，觸酶試驗為陽性。全自動微生物鑒定系統VITEK－32的GPI卡的鑒定結果為Streptococcus anginosus（Strep．milleri）（咽峽炎鏈球菌）或Streptococcus asnguinis（Streptococcus sanguis）／gordonii（血鏈球菌），鑒定值分別為77%和15%。具體生化特性見表1。

表1 GPI卡VITEK－32全自動微生物鑒定系統生化鑒定結果

2．4 藥敏試驗結果 紙片法藥敏試驗結果為先鋒必、先鋒Ⅴ、先鋒噻肟、青霉素G、氨芐青霉素、氧呱嗪青霉素、苯唑青霉素、菌必治高度敏感；復達欣、頭孢拉定、氧氟沙星、萬古霉素、氯霉素敏感；環丙沙星、阿米卡星、氟哌酸、強力霉素低敏；紅霉素、卡那霉素、利福平、呋喃妥因、痢特靈、鏈霉素、妥布霉素、慶大霉素、四環素、復方新諾明完全耐藥。

2．5 動物試驗結果 接種后表現為精神沉郁，拉稀，厭食，腳軟，接種后第2天死亡3只，第4天死亡2只。隨后，剩余的3只，精神、食欲逐漸轉好，到接種后11d，基本痊愈。對照組鴨只正常。從每只病死鴨的肝臟和心血中，均分離到菌落形態一致的細菌，經鑒定，形態與生化特性與接種菌相同，成功的進行了人工發病試驗，進一步證實了本病例的病原為該鏈球菌。

2．6 擴增結果 PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見1 500bp左右的特異條帶（圖4），與預期大小相符。

2．7 序列分析 測序結果已提交GenBank（收錄號為JN594664），將所得菌株的16SrRNA基因序列在NCBI上用BLAST進行同源性比較，結果與Streptococcus pasteurianus（巴氏鏈球菌，序列號AP012054）相似性達100%。在最靠前25個序列中，有16個為巴氏鏈球菌，有6個為Streptococcus gallolyticus（解沒食子酸鏈球菌），另3個為未能鑒

圖4 PCR擴增結果

定的細菌，與該菌株的相似性在98%～100%。從GenBank數據庫中選取不同種的鏈球菌參考株14株，沙門菌、鴨疫里默氏菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、多殺性巴氏桿菌各1株（見表2），將其16S rRNA基因序列，用軟件 MEGA 5．05進行多序列匹配排列，以Neighbor－Joining方式進行同源性比較，并繪制進化樹。結果發現，各種鏈球菌16S rRNA基因序列間存在一定的差異，但差異不超過4%，本菌與巴氏鏈球菌參考株關系最近；其次為解沒食子酸鏈球菌、牛鏈球菌，相似性均超過了99%；與咽峽炎鏈球菌相似性為98．46%；與變形鏈球菌的距離最遠，差距達3．17%。本菌與大腸桿菌、沙門菌、銅綠假單胞菌、巴氏桿菌的同源性差異約為14%；與鴨疫里默氏菌的同源性則更遠，超過16%（圖5）。

表2 參考16SrRNA基因序列來源及數據庫存取號

圖5 16SrDNA序列分析結果

3 討論

3．1 本分離株生化鑒定結果為咽峽炎鏈球菌，鑒定值較為77%，通過進一步測定其16SrRNA基因序列，其與巴氏鏈球菌最為接近，兩種鑒定結果存在差異，但由于生化鑒定值較低，僅為77%，且其16S rRNA基因序列與咽峽炎鏈球菌的相似性為98．46%，低于“同一個種同源性為98．8%的標準”［2］，故將本分離株定為巴氏鏈球菌。

3．2 將分離株接種健康雛鴨，成功復制出與原來相同的癥狀及病變，發病率達100%，致死率達62．5%，說明本病例由巴氏鏈球菌引起，且本巴氏鏈球菌分離株具有較強的毒力。鴨鏈球菌病多感染雛鴨，多呈急性敗血性感染，鳥鏈球菌、獸疫鏈球菌、糞鏈球菌等感染雛鴨，獸疫鏈球菌感染成鴨的鏈球菌病已有報道［3］，但由巴氏鏈球菌引起的未見報道，在當前養鴨業不斷朝著集約化方向發展，養殖密度不斷增大，水質日益惡化的條件下，該菌的致病作用增強，是否會成為危害養鴨業的一種新病需引起關注。

3．3 本病可通過用藥進行治療和預防。對該菌株的藥敏試驗結果顯示，青霉素類藥物高敏，氯霉素類藥物敏感，本病例中及時應用氟苯尼考進行治療，成功的地控制了病情，將死亡率降至2%以下，及時用藥物進行治療是減少損失的關鍵。

3．4 對于本病的預防，除了在發病敏感期前使用藥物外，更重要的是采取降低飼養密度，優化水質，改善飼養條件，加強環境消毒等綜合防控措施。

3．5 通過16SrRNA基因的序列測定，從分子遺傳進化和分子水平對細菌進行鑒定，使細菌鑒定更加科學與準確［4］。當前，對鏈球菌屬的各種細菌進行鑒定，存在一定的難度，但以16SrRNA基因序列相為基礎，加上酶切分析及各種的特征性序列分析，能很好的將鏈球菌鑒定到種［5］，16SrRNA序列測定可作為細菌鑒定的一種可靠方法。

［1］ Y．M．Saif．禽病學（第十一版）［M］．蘇敬良，高福，索勛譯．北京：中國農業出版社，2005：917－921．

［2］ 韓文瑜，馮書章．現代分子病原細菌學［M］．長春：吉林科學技術出版社，2003：160．

［3］ 李峰，苗立中，沈志強，等．鴨鏈球菌病的診斷與防治［J］．水禽世界，2009，2：39－40．

［4］ Lee－Jene Teng，Po－Ren Hsueh，Yu－Hsuan Huang，etal．I－dentification of bacteroides thetaiotaomicron on the basis of an unexpected specific amplicon of universal 16Sribosomal DNA PCR［J］．Journal of Clinical Microbiology，2004，42（4）：1727－1730．

［5］ Margot E，Grinwis Christopher D，Sibley Michael D，Parkins，etal．Characterization of streptococcus milleri group isolates from expectorated sputum of adult patients with cystic fibrosis［J］．Journal of Clinical Microbiology，2010，48（2）：395－401．