殼聚糖復方制劑對蛋雞脂肪肝的治療作用的試驗

彭佳麗，胡國良，王小鶯，郭小權，曹華斌，胡小明

（1．江西農業大學動物科學技術學院，江西 南昌330045；2．江西省余江縣畜牧獸醫局，江西 余江335200）

脂肪肝綜合征是一種脂類代謝紊亂疾病，以肝臟脂肪過度沉積或伴有肝臟出血為特征，發生率與遺傳、環境、內分泌、激素的影響，有毒物質等因素有關。殼聚糖是甲殼質經脫乙酰反應后的產品，屬于氨基多糖，被譽為生命要素之一，與機體之間有良好的生物相容性，并且具有多種藥理作用，提高機體免疫力，抗腫瘤，抗氧化，抗自由基。中醫治療脂肪肝主要以化痰祛濕、活血化癖、疏肝解郁、健脾消導為主，同時輔以清熱解毒、利膽化積、補腎養肝等方法［1］。本試驗將殼聚糖合并中藥，以常用藥氯化膽堿為對照藥物，研究復方殼聚糖中藥制劑對蛋雞脂肪肝的治療效果及作用機理，為中藥應用于臨床降低脂肪肝發病率提供理論基礎。

1 材料

1．1 試驗動物 海褐藍蛋雞280日齡120羽，平均體重1．5kg±0．25kg（購自江西九江某種雞場）。雞只飼養環境相同，自由采食和飲水，16h光照。

1．2 試驗藥物及試劑 殼聚糖（水溶性，脫乙酰度90%，購自青島云宙生化有限公司），氯化膽堿（含量：50%，購自南昌獸藥店），復方中藥（柴胡15g、黃芩9g、芍藥9g、生姜15g、大黃6g等，購自江西農業大學校醫院）。殼聚糖復方制劑的配制：中藥濃縮至每1mL含生藥0．5g的溶液，合并殼聚糖0．5g（殼聚糖的量按飼料的1%添加）混合配制，4℃冰箱保存（3d內用完）。天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT），乳酸脫氫酶（LDH）、脂蛋白酯酶（LPL）試劑盒由南京建成生化試劑廠生產。

1．3 飼料配方 對照組日糧參照美國NRC（1998）蛋雞營養需要配合而成；試驗組日糧除了能量、蛋白含量外，其他營養需要均參照美國NRC（1998）蛋雞營養標準配合而成。配方及營養水平見表1（配方一：基礎日糧；配方二：高能低蛋白日糧）。

表1 試驗基礎日糧構成

預混料配方：蛋雞用多維299．10mg，銅4．95mg，鐵31．30mg，錳41．21mg，鋅42．04mg，碘0．61mg，硒0．15mg，沸石粉2465．28 mg，蛋氨酸997．01mg，桿菌鈦鋅39．93mg，抗氧喹164．5mg，膽堿448．65mg，糠3489．53mg

2 方法

2．1 蛋雞脂肪肝綜合征病理模型的建立 獸醫臨床上，一般對天門冬氨酸氨基轉移酶、丙氨酸氨基轉移酶、膽堿酯酶等肝臟特異性酶的檢驗來進行肝臟疾病診斷［2］。組織學上每單位面積有三分之一以上的肝細胞發生脂肪變性，亦可判定為脂肪肝。本試驗采用高能低蛋白飼料飼喂，通過酶學診斷和病理切片來判定蛋雞脂肪肝造模是否成功。雞只適應環境1周后，將蛋雞分為四組：A組飼喂基礎日糧（配方一），B、C、D組飼喂高能低蛋白日糧（配方二），飼喂45d。

2．2 殼聚糖復方制劑對雞脂肪肝綜合征的療效試驗造模成功后，開始治療試驗。記錄試驗過程中各組雞精神、發病和死亡情況。A組飼喂配方一日糧，B組繼續飼喂配方二飼料；C組在飼喂配方二的基礎上，飲水中添加殼聚糖復方制劑溶液2mL／只雞；D組在飼喂配方二的基礎上，添加氯化膽堿，劑量為2 g／kg飼料。在給藥15d、30d取每組抽取6只雞，頸靜脈采血后剖殺，，取血液和肝臟勻漿測定生化指標，觀察并記錄各器官組織的肉眼變化。生化指標測定方法按照試劑盒說明書步驟嚴格規范執行。

2．3 血清樣品采集 屠宰前禁食12h，心臟采血10mL，試管分裝，先放入生化培養箱中1h，然后放入4℃冰箱3h，析出血清，離心分裝于eppendorf管中，置－4℃ 冰箱保存。

2．4 勻漿制備 分別取同一部位肝臟樣品30g左右，包于封口袋，液氮冷凍，置－80℃冰箱保存。切取部分肝臟，按1∶9的重量體積比加入生理鹽水，勻漿后，于2 500r／min離心10min，取上清液測定。

2．5 病理學觀察 將固定于10%福爾馬林的組織塊，于72h后取適宜大小肝臟做常規石蠟包埋，H．E．染色，光鏡觀察并記錄病理組織學變化。

2．6 數據處理 數據均以（平均值X±標準誤SE）形式表示，應用SPSS統計分析軟件單因素方差分析組間差異顯著性，進行各組間均數的多重比較。

3 結果

3．1 蛋雞脂肪肝綜合征病理模型的建立

3．1．1 酶學檢測 試驗第45天，A組與B組、C組、D組的ALT、AST活力差異顯著（P＜0．05），B、C、D組ALT、AST活力明顯升高，結合病理學變化，確定造模成功。

表3 高能低蛋白飼料對蛋雞AST和ALT的影響

3．1．2 病理學觀察 試驗第45天，剖檢雞只，A組肝臟未見異常，色澤紫紅，腹腔脂肪及腸系膜等處可見少量脂肪，B組、C組、D組肝臟腫大呈淡黃色或黃褐色，嚴重者肝臟破裂出血、質脆，用刀切時，刀面有脂滴附著，切面外翻，腹下、皮下、心包、胃及腸系膜均有大量脂肪沉積，膽囊腫大，膽汁充盈。從組織學變化來看，試驗第45天，對照A組肝細胞大小、形狀都比較正常，未見脂肪空泡、腫大變性現象，排列整齊，B、C、D三組肝細胞均有少量壞死，細胞腫大，胞核擠向一側，且細胞內均有大小不一，數量不等的脂肪空泡，肝索和肝竇的結構不清晰。

3．2 殼聚糖復方制劑對雞脂肪肝綜合征的療效試驗

3．2．1 殼聚糖復方制劑對肝臟乳酸脫氫酶（LDH）活力的影響 給藥15d，B組活力明顯高于A組、C組、D組，差異均顯著（P＜0．05），C組、D組活力差異不顯著（P＞0．05）；給藥30d，B組與 A組、C組、D組差異顯著，說明隨著治療時間的延長，殼聚糖復方制劑對肝臟LDH活力的抑制作用更加明顯。

表6 乳酸脫氫酶（LDH）活力 （U／L）

3．2．2 殼聚糖復方制劑對肝臟脂蛋白酯酶（LPL）活力的影響 給藥15d，B組與C組、D組差異顯著（P＜0．05），添加殼聚糖復方制劑后，C組LPL活力顯著升高。給藥30d，B組與C組差異顯著（P＜0．05），與健康A組差異不顯著（P＞0．05），并且殼聚糖復方制劑治療效果優于氯化膽堿。A組活力降低，這可能與溫度增高，雞對能量的需求少，脂肪分解減少，便造成機體脂肪沉積。

表7 脂蛋白酯酶（LPL）活力 （U／L）

3．2．3 病理學觀察 試驗結束時，B組肝臟呈土黃色且有明顯出血點，有些地方出現凝血塊，其他癥狀與第45天相似。C組和D組在給藥30d，與同期B組相比，明顯紅潤，外觀基本正常。組織學觀察到，給藥30d后，對照A組肝臟出現了少量空泡，且整個結構不呈正常的放射狀排列，說明在高溫季節，日糧沉積也可造成一定程度肝變性，脂質含量增多。B組細胞間界限消失，整個視野下只見脂肪空泡，脂肪顆粒彌漫性浸潤，肝細胞邊緣只有少量細胞質，肝細胞索和肝竇結構消失，整個肝臟成網狀結構。C組和D組肝臟未見肝細胞空泡，肝細胞大小、形狀、排列及肝竇大小均表現正常，與第45天時相比，肝細胞變性程度明顯減輕。

4 討論

4．1 蛋雞脂肪肝綜合征病理模型的建立 當肝脂逐漸增加時，肝細胞機能降低，細胞膜破壞受損，致使高能低蛋白飼料的能量不能正常轉化，甘油三酯在肝臟蓄積，肝臟受損，高產期的蛋雞合成雞蛋時，加重肝臟的代謝功能，肝臟超負荷工作，也是造成肝臟受損變性的原因之一［3］。本試驗中，第45天，B、C、D組ALT、AST活力明顯高于A組。顯微鏡下觀察脂肪滴充滿細胞致使肝細胞腫大變性，界限模糊，低倍鏡下每個視野有三分之一的肝細胞發生脂肪變性或中倍鏡下每個視野有二分之一的肝細胞發生脂肪變性。曹華斌［4］等均采用高脂飼料喂飼試驗動物，與空白對照組相比，脂肪肝模型組肝指數、脂質含量均高于空白對照組。表明高能低蛋白飼料能成功建立動物脂肪肝模型。

4．2 殼聚糖復方制劑對雞脂肪肝綜合征的療效試驗

Ormrod等［5］對缺乏載脂蛋白E的動脈粥樣硬化小鼠飼喂含有5%食用殼聚糖的飼料20周后，發現殼聚糖能顯著降低血清膽固醇。殼聚糖對脂肪肝的作用機理可能與其正電性有關，正電性的殼聚糖和負電性的膽汁酸結合排出體外，脂肪不被乳化，影響脂肪的消化吸收，降低血清甘油三酯含量，同時由于殼聚糖與膽汁酸結合排出體外，重新吸收入肝臟中的膽汁減少膽囊排空，而膽囊中必須有一定量的膽汁酸儲備，這就促進肝臟將膽固醇轉化成膽汁酸，使血液膽固醇含量降低［6］；堿性的殼聚糖在胃中能與胃酸作用形成凝膠，在腸內pH值條件下可以保持該凝膠不分解，且具有吸附膽汁酸和膽固醇的作用。吸附了膽汁酸和膽固醇的殼聚糖凝膠隨著糞便排出體外，從而降低了血中的脂肪和膽固醇，減少了脂肪的吸收，因而降低了血清總膽固醇和甘油三酯的水平［7］。

中藥柴胡皂苷可以有效地穩定肝細胞膜系統，具有鎮靜止痛，解熱，抗病毒，抗炎，抗癌，降血脂，保肝，提高免疫力的作用。黃芩化學成分主要含有黃酮類成分，具有抗氧化功能，清除機體由于受損或衰老產生的自由基，對肝臟和心血管都有保護作用。大黃可以排除微循環障礙，恢復組織細胞的代謝功能及血液的供應，增強肝細胞再生能力。Ahmed和Fuhrman均發現，生姜可以調節大鼠脂質過氧化和氧化度，降低體內脂質過氧化物［8］。其機理可能與上述藥物在降脂同時，兼以保肝、改善微循環、減輕脂質過氧化等，從不同的環節作用于肝臟而產生的互補作用有關。本試驗表明，殼聚糖復方制劑可明顯降低LPL活性，LDH活力升高，減輕了肝臟的炎性損傷和脂肪變性程度。綜上所述，通過添加殼聚糖復方制劑，對動物脂肪肝有一定的治療效果。

［1］ 曹小菊．中醫對脂肪肝的認識及治療現狀［J］．中醫雜志，2000，41（6）：373－375．

［2］ Pappo I，Bercover H，Berry，etal．Anti－tumor necrosis factor antibodies reduce hepaticstreatosis during total parenteral nutrition and bowel rest in the rat［J］．JPEN J Parenter E nteral Nutr，1995，19：80．

［3］ 何維明，楊福有，趙同育，等．飼料蛋白能量比值與雞脂肪肝綜合征發生率的關系研究［J］．畜牧獸醫 學報，1992，23（2）：107－111．

［4］ 曹華斌，胡國良，郭小泉，等．高能低蛋白日糧飼養蛋雞肝臟脂肪沉積及其組織病理學觀察［J］．中國獸醫學報，2010，30（7）：1009－1012．

［5］ Ormrod D J，Holmes C C，Miller T E．Dietary chitosan inhibits hypercholesterolaemia and aterogene－sis in the apolipoprotein E－deficient mouse model of atherosclerosis［J］．Atherosclerosis，1998，138（2）：329－334．

［6］ Thongngam M，Mclements D J，etal．Characterization of interactions between chitosan and an anionic surfactant［J］．Agric Food Chem，2004，52（4）：987－991．

［7］ 來水利，王克玲．殼聚糖及其衍生物的降血脂作用機理［J］．日用化學品科學，2008，31（10）：30－32．

［8］ Fuhrman B，Rosenbat M，Hayek T，etal．Ginger extract consumption reduces plasma cholesterol，inhibits LDL oxidation and attenuates development of atherosclerosis in atherosclerotic，apolipopro－tein E deficient mice［J］．J Nutr，2000，130（5）：1124－1131．