補充肌酸對老齡大鼠骨骼肌收縮特性的影響①

楊霖，高前進

肌肉衰減癥(sarcopenia)是由增齡引起骨骼肌肌肉量減少，導致肌肉力量減弱和活動受限，受傷的危險性增高[1]。事實上從40歲起，人的骨骼肌就開始不斷衰減，并且衰減速度隨增齡而增加。有研究報道70歲以下老年人群中有13%～24%患有肌肉衰減癥，而80歲以上的老年人中則超過50%[2]，給社會及家庭帶來沉重的負擔。

目前治療肌肉衰減癥的常用辦法是抗阻力訓練和注射睪酮[3-4]。然而，睪酮對老年人有副作用，不主張廣泛使用[5]。服用肌酸可能是一種安全、有效且經濟的治療手段，補充肌酸能夠減少因增齡引起的肌肉質量下降，增加肌肉力量[6]和Ⅱ型肌纖維直徑[7]。

有眾多研究反復報導肌酸能夠增加35歲以下成年人肌肉功能，尤其結合抗阻力訓練效果更好[8]。然而，肌酸對老年人骨骼肌影響的研究卻較少，而且大多數研究側重于補充肌酸后的生化變化[9-10]，對于補充肌酸前后肌肉收縮特性的變化缺乏深入的研究。因此，本實驗通過觀察補充肌酸前后骨骼肌收縮特性等參數的變化，尋求提高老年人骨骼肌功能的方法，對提高老年人生活質量、節省醫療資源具有一定的現實意義，同時對老年肌肉衰減癥治療方法的研究也具有一定的價值。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性清潔級Sprague-Dawley大鼠20只，18月齡(相當于人55～60歲[11])，體重(404±8.10)g，購自河北醫科大學實驗動物中心，選用國家標準嚙齒類動物干飼料喂養，自由飲食，自然光照，室溫18～22℃，濕度40%～45%。隨機分為對照組和肌酸補充組(0.3 g/kg?d[12])，每組10只。飼養6周于末次灌胃后取材。實驗在河北醫科大學病理生理學實驗室完成。

1.2 大鼠體重與肌肉濕重測量

6周后戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉大鼠，分別稱量對照組和肌酸補充組大鼠體重。取右側比目魚肌和趾長伸肌測量濕重后用于肌酸和磷酸肌酸的測量；左側比目魚肌和趾長伸肌用于離體收縮功能測量。心臟取血2 ml，3000 r/min，4℃離心10 min，取上清液，-70℃保存。

1.3 肌磷酸肌酸、肌酸的測定

1.3.1 儀器和試劑 惠普1050型高效液相色譜儀，包括惠普1050系列自動進樣系統、四元梯度泵、DAD二極管陣列檢測器及HP3D化學工作站軟件：美國惠普公司；Eyela FD凍干機：日本Rikakikai公司；Nissei AM-6高速組織勻漿機：日本Ace公司；METTLER電子分析天平：瑞士梅特勒-托利多公司；J2-21型低溫超速離心機：美國Beckman公司；超低溫冰箱：日本三洋；ZBE30-107制冰機：ZIEGRA公司。

分析純磷酸和磷酸肌酸：美國SIGMA公司；分析純β-硫代巴比妥酸(2-thiobarbituric acid,TBA)、高壓液相級乙腈、NaH2PO4、NaOH、HClO4：天津化學試劑二廠。

1.3.2 色譜條件固定相 色譜柱為YWG-C 18(5 μm，250×4.6 mm I.D.)：大連化學物理研究所；流動相：所有流動相均用雙蒸水配置。流動相A為含有0.1 mol/L NaH2PO4和2 g/L TBA的混合液，然后用2 mol/L NaOH調pH至5.5；流動相B為流動相A和乙腈按75∶25體積比混合的混合液。實驗當天流動相經孔徑為0.45 μm的微孔濾膜過濾。磷酸肌酸與肌酸的檢測波長為210 nm；檢測靈敏度0.01 AUFS，檢測進樣量為5 μl。

1.3.3 標本處理 從液氮中取出骨骼肌標本，置于凍干機中過夜凍干，然后做成凍干粉。把肌肉粉末倒入小試管中，編號，加蓋密封，置于-80℃低溫冰箱中保存。測定前準確稱取骨骼肌凍干粉60 mg左右，放入5 ml聚乙烯微離心管中，然后滴入預冷的濃度為0.4 mol/L的過氯酸2 ml，用預冷的電動高速勻漿機勻漿2 min，然后低溫離心10 min；吸取400 μl上清液放入另一試管中，加入2 mol/L的KHCO380 μl，然后再低溫離心10 min，取上清液200 μl保存于-80℃低溫冰箱中待分析[13]。

1.4 收縮功能測量[14-15]

剪開后肢小腿皮膚，輕輕游離比目魚肌，用0號絲線行近心端肌腱結扎，置于氧合的Krebs-Henseleit溶液中清洗肌肉表面血液，水平置于容量為1 ml的肌槽中；近心端肌腱用絲線結扎固定于等長張力傳感器(TB-651日本光電)的不銹鋼鉤上，遠心端肌肉則被夾于彈簧夾中。用27℃Krebs-Henseleit溶液按10 ml/min行非循環灌流。灌流液組成：120.0 mmol/L NaCl， 4.7 mmol/L KCl， 1.2 mmol/L NaH2PO4， 1.2 mmol/L MgSO4，2.5 mmol/L CaCl2，20.0 mmol/L NaHCO3，10.0 mmol/L葡萄糖。以95%O2和5%CO2的混合氣體充分氧合，使pH維持在(7.4±0.20)。電刺激器(SEN-3301，日本光電)輸出脈寬20 ms、間隔20 ms與電壓為6 V的方波脈沖刺激。先平衡約20 min，然后以0.1 mm增量，逐步拉伸比目魚肌至等長收縮張力為最大時的肌肉初長Lmax位置，平衡10 min，記錄肌肉長度與張力，接下來所有值的測量都在肌肉初長度Lmax位置測量。再以0.5 V的步幅，逐步降低刺激電壓至3 V，在每一新電壓刺激點平衡3 min后，記錄收縮張力。

強直收縮時，以脈寬5 ms、間隔40 ms與電壓為6 V的方波脈沖刺激45 s，使肌肉產生高頻強直收縮，強直收縮最大張力用P0表示。比目魚肌試驗完成后，取趾長伸肌，按相同方法固定與平衡，采用脈寬10 ms、間隔20 ms與電壓為6 V的方波脈沖刺激。

10 min后，肌肉抗疲勞性測量使用低頻疲勞方案30 Hz，300 ms，每次刺激2 s，共5 min。為了更好地比較肌肉抗疲勞特征，肌肉張力值被標準化，都用百分比表示，以初始測得的張力值為標準(100%)，所有刺激產生的張力除以初始張力值，乘以100%。刺激時間點，前60 s分別在第8、16、24、32、40、48、56秒刺激，然后分別在第60、120、180、240、300秒刺激。

實驗結束后，用濾紙吸干肌肉表面附著的水分并稱質量，再按文獻[16]公式計算每一肌肉的橫截面積，張力數據用橫截面積作歸一化處理。

1.5 統計學分析

用SPSS 10.0統計學軟件對結果數據進行統計學分析，組間差異比較采用單因素方差分析法，顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 體重與肌肉濕重

喂養前大鼠體重為(404.20±8.10)g。喂養6周后，對照組大鼠隨年齡增長體重出現明顯增加，由喂養前的404.70 g增加到442.70 g；肌酸補充組體重增加更加明顯。肌酸補充組比目魚肌濕重和趾長伸肌濕重均高于對照組(P＜0.05)。見表1。

2.2 肌酸和磷酸肌酸含量

喂養6周后，肌酸補充組比目魚肌和趾長伸肌細胞中肌酸和磷酸肌酸含量增加，與對照組相比有顯著性差異(P＜0.05)。見表2。

2.3 收縮特性

與對照組比較，肌酸補充組比目魚肌最大收縮力(Pt)增大，強直最大收縮力(P0)增大，達到最大收縮力的時間(TPT)縮短，從峰值張力舒張一半的時間(TPR50)縮短，但只有和TPR50與對照組具有顯著性差異(P＜0.05)；肌酸補充組趾長伸肌Pt增大，P0增大，TPT縮短，與對照組具有顯著性差異(P＜0.05)。見表3。

2.4 比目魚肌、趾長伸肌抗疲勞性

在前2 min，兩組張力分別降低到初始張力的(72±5.2)%和(79±4.8)%；在后3 min，對照組張力繼續降低，而肌酸補充組肌張力沒有進一步降低，第5分鐘時對照組張力降到初始張力的(46±6.7)%，肌酸補充組張力降到初始張力的(70±6.4)%。見圖1。

肌酸對趾長伸肌抗疲勞性有一定影響，但與對照組比較無顯著性差異。5 min疲勞方案的刺激后，對照組張力降到初始張力的(47±12.8)%，肌酸補充組張力降到初始張力的(55±13.4)%。在開始刺激后對照組和肌酸補充組張力出現一個漸進性的增加，這種增加持續20～30 s，然后開始降低。120 s刺激后張力已經回落到初始張力水平(100%)。值得注意的是肌肉張力增加的幅度，對照組在第24秒時達到初始張力的(164±21)%，肌酸補充組達到初始張力的(190±11)%，肌酸補充組張力增加幅度比對照組大，具有顯著性差異(P＜0.05)。見圖2。

表1 兩組大鼠體重與肌肉濕重(g)

表2 兩組比目魚肌、趾長伸肌細胞肌酸和磷酸肌酸含量(mmol/kg干重)

表3 肌酸補充對比目魚肌、趾長伸肌收縮特性的影響

圖1 兩組比目魚肌抗疲勞性

圖2 兩組趾長伸肌抗疲勞性

3 討論

本研究主要檢查6周肌酸補充對老年大鼠比目魚肌和趾長伸肌收縮特性、抗疲勞特性的影響。實驗發現每天0.3 g/kg體重的肌酸劑量，喂養6周大鼠體重增加，比目魚肌和趾長伸肌濕重增加，肌肉中肌酸和磷酸肌酸含量比正常對照組增加(P＜0.05)。由此看來，補充肌酸對老齡骨骼肌效果顯著。

2000年Tarnopolsky曾提出假設，補充肌酸對老年人的影響也許比年輕人更大[17]，后來大量支持性文章報道老年人肌細胞內源性總肌酸含量比年輕人低，含有較低內源性肌酸的個體比含有較高內源性肌酸的個體對補充肌酸反應更大[18-19]。已有研究證明Ⅱ型肌纖維橫斷面積減少是增齡引起肌肉量減少最主要的反應，肌肉活檢發現ⅡA和ⅡB肌纖維橫截面積隨增齡降低15%～25%[20]，肌酸具有恢復老齡肌肉Ⅱ型肌纖維的功效。很多研究認為補充肌酸促進肌肉肥大的機制主要包括：肌酸使肌細胞腫脹，這可作為一個信號減少蛋白水解和氨基酸氧化，改變肌細胞基因轉錄因子的表達，增加衛星細胞有絲分裂活動[21]，因此服用肌酸后肌肉濕重增加，肌纖維增粗。現在普遍認為肌酸提高骨骼肌功能是由于增強磷酸肌酸能量系統，正如本實驗觀察到的肌酸和磷酸肌酸含量增高，磷酸肌酸能量系統功效增強使ATP生成增多，進而個體運動能力增加[22]，受試者能承受高強度、長時間的負荷。

肌肉收縮特性研究使用離體比目魚肌和趾長伸肌30℃灌流方法，測量其單次收縮和強直收縮。實驗發現比目魚肌Pt和P0增大，TPT及TPR50縮短，但只有TPR50與對照組相比具有顯著性差異(P＜0.05)。趾長伸肌Pt和P0增大、TPT縮短，且與對照組相比具有顯著性差異(P＜0.05)，時間參數TPR50雖縮短，但與對照組相比無顯著性差異(P＞0.05)。以上結果說明，6周的肌酸補充使老年大鼠骨骼肌收縮特性均出現良好的變化。但是，肌酸對趾長伸肌影響更顯著，Pt、P0和TPT與對照組有顯著性差異。分析其原因可能是增齡引起的肌肉量減少主要是由于Ⅱ型肌纖維橫截面積減少，而肌酸能幫助保持Ⅱ型肌纖維質量不隨增齡減少。Sipila等報道，在不進行訓練刺激的情況下，肌酸補充能夠增加Ⅱ型肌纖維直徑[23]。趾長伸肌主要含有Ⅱ型肌纖維，是典型的快肌，肌酸補充能幫助保持趾長伸肌肌纖維質量不隨增齡減少，磷酸肌酸系統功效增強。在運動訓練中肌酸常被運動員用作提高短時間爆發力項目的營養補品，對快肌(Ⅱ型肌纖維)效果顯著。也許這些正是趾長伸肌Pt、P0顯著增強和TPT縮短的原因。

6周的肌酸補充使比目魚肌TPR50顯著降低的最可能的解釋是肌漿網Ca2+泵活動的改變。Ca2+泵活動時所需ATP主要來自磷酸肌酸，肌肉磷酸肌酸增加可導致Ca2+泵活動增強。在培養的骨骼肌細胞，補充肌酸使磷酸肌酸增加后，肌漿網Ca2+泵攝Ca2+能力明顯增強[24]。對肌酸補充顯著降低比目魚肌的TPR50，而趾長伸肌的TPR50沒有出現顯著性變化，可能的解釋是肌酸對比目魚肌和趾長伸肌舒張時間的影響可能與不同肌纖維類型上Ca2+泵的特性有關，慢肌和快肌上表達不同的Ca2+泵亞型，不同Ca2+泵亞型對調節表現出不同的敏感性[25]。所以，雖然補充肌酸導致在比目魚肌和趾長伸肌相似的磷酸肌酸增加，但是兩種肌肉類型Ca2+泵對磷酸肌酸的反應卻不同。

肌酸對比目魚肌和趾長伸肌產生不同影響也表現在對肌肉抗疲勞性影響方面。肌酸補充后趾長伸肌抗疲勞性顯著提高，而趾長伸肌的抗疲勞性沒有明顯提高。實驗采用的低頻刺激方案由重復的亞極量強度強直刺激組成。刺激導致的低頻疲勞使無機磷酸鹽和H+增加[26]；無機磷酸鹽和H+降低肌原纖維對Ca2+的敏感性，由此導致疲勞性的張力降低[27]。這種類型的疲勞方案導致的張力降低也與肌肉的有氧供能能力相關。高有氧供能能力的肌肉更具有抗疲勞性。肌酸補充后比目魚肌抗疲勞性增強與增加的有氧供能能力相關，與Brannon[18]報道的結果相一致。Brannon的研究證實補充肌酸增加了慢縮的比目魚肌有氧供能能力，而沒有增加快縮的股外側肌的有氧能力，說明影響是有肌纖維類型依賴性的。這些研究結果也許可以解釋為什么本研究觀察到肌酸使比目魚肌抗疲勞性顯著增加而趾長伸肌沒有顯著增加。

但是在疲勞測試中，肌酸增加了趾長伸肌肌張力短時間增加的幅度(圖2)，肌肉張力增加的幅度，對照組在第24秒時達到初始張力的(164±21)%，肌酸補充組達到初始張力的(190±11)%，肌酸補充組張力增加幅度比對照組大(P＜0.05)。產生這種影響的機制我們認為是由于增加了磷酸肌酸，而趾長伸肌是快肌，對磷酸肌酸非常敏感，磷酸肌酸能增強快肌短時間爆發式用力的能力。

本實驗研究發現，補充肌酸能夠安全地增強老年骨骼肌的收縮力量，使肌肉肥大，增加肌肉的抗疲勞能力，不同的肌纖維類型影響不同。結合文獻與我們的研究結果，我們強烈推薦肌酸是安全、經濟、有效的營養劑，可以延緩因老齡引起的肌肉廢用，尤其推薦在服用時結合抗阻力訓練效果更好。將來的研究應該關注影響肌酸轉運進入骨骼肌的因素，例如肌酸轉運蛋白的濃度及口服吸收量，還應研究老年人服用肌酸時理想的劑量和服用次數，以及與蛋白質結合使用等問題，以期為老年骨骼肌康復作出貢獻。總之，補充肌酸對老年骨骼肌具有良好的營養作用。

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