應用生物信息學方法篩選豬肺炎支原體保護性抗原

王豪舉，王 博，丁紅雷，2

（1．西南大學動物科技學院，重慶 北陪400715；2．重慶生產(chǎn)力促進中心，重慶 渝北401147）

豬支原體肺炎是由豬肺炎支原體（Mhp）引起的一種慢性、接觸性傳染病，是豬場最常見的疫病之一。該病通常不引起豬只的死亡，但會使其出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難等癥狀，造成食欲減退、生長阻滯，飼料轉(zhuǎn)化率降低。該病通常與豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病毒病、偽狂犬病等病毒性疾病和副豬嗜血桿菌病、巴氏桿菌病、鏈球菌病等細菌性疾病相互影響，形成豬呼吸系統(tǒng)疾病綜合征（Porcine respiration Disease Complex，PRDC），造成養(yǎng)豬業(yè)的重大損失。

面對該病造成的嚴重危害，疫苗的使用成為防控該病的首選，而疫苗研制的核心是尋找和鑒定保護性抗原。反向疫苗學［1］研究策略的建立，使得人們能夠從病原微生物的全基因組序列出發(fā)，全面系統(tǒng)地預測、分析和驗證這些病原微生物的全部可能的候選疫苗蛋白抗原。目前已經(jīng)有4個Mhp菌株的全基因組測序工作完成，包括3個強毒株和1個無毒株，這為我們應用反向疫苗學方法分析和預測Mph疫苗候選抗原創(chuàng)造了條件。本文著重論述了采用生物信息學方法，以Mhp強毒株232菌株作為出發(fā)菌株，結(jié)合其他菌株的基因組信息，從全基因組水平篩選候選抗原，為后續(xù)的研究提供候選抗原靶點。

1 材料與方法

1．1 材料 Mhp232、Mhp168、Mhp7 448、Mhp J菌株全基因組序列及其他相關(guān)基因序列從美國國立生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／）獲得。

在線預測軟件SignalP 3．0［2］、DAS［3］、PSOR－Tb［4］、CELLO［5］、SOSUI－GramN［6］等通過互聯(lián)網(wǎng)獲得。

1．2 在線預測 外膜蛋白和分泌蛋白是首選的疫苗候選蛋白抗原。我們采用逐級縮小范圍和平行預測相結(jié)合的方法預測該類蛋白。

以能引起豬支原體肺炎典型臨床癥狀的Mhp強毒株232株作為基礎(chǔ)，根據(jù)其全基因組對應的相應氨基酸序列，用SignalP 3．0軟件預測并篩選含有信號肽的蛋白；同時，用DAS軟件預測有跨膜區(qū)蛋白。將同時有信號肽和跨膜區(qū)的蛋白作為下一步預測的候選蛋白。

用PSORTb 3．0．2、CELLO version 2．5、SOSUI－GramN進一步預測上述蛋白的亞細胞定位，這3個軟件均能預測革蘭陰性細菌和支原體的胞質(zhì)蛋白、內(nèi)膜蛋白、周質(zhì)蛋白、外膜蛋白和分泌蛋白。

根據(jù)上述結(jié)果，選取同時含有信號肽和跨膜區(qū)并被3個預測亞細胞定位的軟件有兩個預測為外膜蛋白或分泌蛋白的蛋白作為下一步預測的候選蛋白。

將上一步預測的蛋白與 Mhp 168、7 448、J菌株的基因組對應的蛋白的氨基酸序列比對，選取同時存在于此4個已測序菌株中且保守型較高的蛋白作為下一步預測的候選蛋白。

將上一步預測的蛋白與豬的基因組中所對應的蛋白的氨基酸序列進行BLAST比對，去除和豬的基因組對應蛋白同源性超過10%的蛋白。剩余的蛋白作為本次預測的疫苗候選蛋白抗原。

2 結(jié)果

2．1 Mhp 232菌株可能的膜蛋白或分泌蛋白預測結(jié)果 Mhp 232菌株基因組全長892 758bp，共編碼691個蛋白基因。為了增加信號肽分析的可靠性，對每一個候選蛋白同時采用SignalP 3．0的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型（Neural Network Model，NN）和隱馬爾可夫模型（Hidden Markov Model，HMM）進行分析，為了避免漏掉可能的候選蛋白，我們把兩個模型中其中有一個預測出可能存在信號肽的蛋白即將其判定為有信號肽。對Mhp232菌株691個候選蛋白的分析表明，有412個蛋白含有信號肽序列。通過用DAS軟件分析預測，共有407個蛋白存在跨膜區(qū)。我們將同時存在信號肽和跨膜區(qū)的301個蛋白判定為下一步預測的候選蛋白。

2．2 Mhp 232菌株可能的外膜蛋白和／或分泌蛋白預測結(jié)果 在預測的Mhp232菌株301個可能的膜蛋白和分泌蛋白中，用PSORTb 3．0．2軟件預測，36個為外膜蛋白、1個為分泌蛋白，32個為可位于多個亞細胞位置的蛋白。用CELLO version 2．5軟件預測，85個為外膜蛋白，4個為分泌蛋白，38個為可位于多個亞細胞位置的蛋白；用SOSUIGramN軟件預測，48個為外膜蛋白，21個為分泌蛋白。將其中兩個軟件共同預測為外膜蛋白和／或分泌蛋白的67個候選蛋白判定為232菌株中初步預測的候選蛋白抗原。

2．3 Mhp疫苗候選蛋白抗原的生物信息學預測結(jié)果 將232菌株中的候選蛋白抗原進一步與168、7 448、J菌株中相對應的氨基酸與核苷酸序列比對，mhp444在J菌株為假基因，mhp017和mhp535基因在7 448菌株中存在同源序列，mhp532和mhp534基因在168菌株中存在同源序列，其余蛋白在其他三個已進行全基因組測序菌株中均存在同源序列。基于 Mhp017、Mhp444、Mhp532、Mhp534和Mhp535蛋白在Mhp菌株中保守性較差，將這5個蛋白在候選蛋白中去掉。其余基因的核苷酸序列同源性在86%～100%，其中只有3個低于95%，氨基酸序列同源性在88%～100%，也只有3個低于95%。

將這些蛋白與豬基因組中的所有基因?qū)牡鞍走M行BLAST序列比對分析，這些蛋白均與Gen－Bank中已存在的豬的蛋白無同源性。將最終預測的62個蛋白均作為Mhp疫苗候選抗原（見表1）。

表1 豬肺炎支原體候選疫苗蛋白抗原

3 討論

目前對豬支原體肺炎尚無很好的治療辦法，臨床上常用抗生素來控制病情的進一步發(fā)展。但隨著耐藥菌株越來越多，該病面臨無藥可用的境地。提高管理水平同時聯(lián)合使用疫苗能夠在一定程度上控制該病的蔓延，且已有多個滅活和減毒豬支原體肺炎疫苗在臨床上使用。但目前市售疫苗仍然存在兩個重要缺陷：一是免疫保護效果較差。接種該疫苗后，只有不超過50%的免疫豬能夠得到有效保護，這一保護比例和人們的期望值相比還有比較大的差距。二是接種疫苗后，豬只仍然能夠帶菌，并在豬群內(nèi)和豬群之間傳播。

從整體防控來看，使用疫苗預防是降低該病發(fā)生，減少經(jīng)濟損失最有前途和最經(jīng)濟的途徑。因此，制備有效的既能預防豬只感染又能顯著降低豬群中病原蔓延的疫苗就成為防控Mhp的核心。重新設(shè)計并制備具有高免疫保護力的疫苗對于預防該病的發(fā)生和病原的傳播有重要意義。采用反向疫苗學策略，從全基因水平來篩選具有高保護性候選抗原是現(xiàn)代疫苗學發(fā)展的方向。一、能夠大量獲取有重要免疫學效應又在病原體內(nèi)表達較少，不能有效刺激機體產(chǎn)生免疫反應的抗原。二、能夠評價傳統(tǒng)疫苗中缺失的與致病密切相關(guān)的分泌蛋白，避免了疫苗設(shè)計中關(guān)鍵蛋白的缺失。三、某些在病原體的致病過程中發(fā)揮重要作用的蛋白，在病原體非天然生存狀態(tài)下，如體外培養(yǎng)中，其表達可能關(guān)閉。這是滅活疫苗制備中的重大缺陷。利用反向疫苗學則可以高效表達和篩選這些蛋白。

合適的保護性抗原首先應該是位于菌體表面或者是分泌性的。這樣的抗原最易與機體的免疫系統(tǒng)接近，激發(fā)機體產(chǎn)生免疫反應。支原體的細胞膜由內(nèi)膜、外膜脂質(zhì)雙層組成，內(nèi)外膜之間構(gòu)成周質(zhì)空間。一些蛋白位于膜上，發(fā)揮傳遞細胞信號、能量物質(zhì)代謝等功能。外膜蛋白和分泌蛋白是病原菌刺激宿主細胞產(chǎn)生免疫應答最主要的蛋白。這也是為什么要選擇外膜蛋白和分泌蛋白作為候選蛋白抗原的原因。其次，保護性抗原應該是保守的。病原體的復制、代謝以及致病是長時間進化的結(jié)果，導致宿主致病也是其獲得物質(zhì)代謝的原料、維持生命活動必不可少的過程。因此，這些維持生命活動的關(guān)鍵蛋白應該是保守的。所以，選擇保守性強的蛋白也是在篩選疫苗候選蛋白抗原的一個重要原則。從本次在全基因組水平預測的結(jié)果來看，Mhp的所有62個候選蛋白抗原存在于所有已測序的Mhp菌株。因此，這些蛋白是保守性很高的候選抗原。

Mhp183（P97）、Mhp378、Mhp677（P65）是目前最常用的 Mhp疫苗候選抗原［7－8］，它的部分功能也已經(jīng)被闡明。但其作為候選抗原制備的疫苗與傳統(tǒng)Mhp疫苗相比免疫效果并無明顯改善，可能這些蛋白不是Mhp致病的最主要的致病因素，或者只是在Mhp導致的宿主細胞病理損傷中的一個小小環(huán)節(jié)，這些環(huán)節(jié)缺失在一定程度上是可以被代償?shù)模蛘哌€需要其他蛋白協(xié)同才能發(fā)揮作用。在Mhp與宿主細胞相互作用的過程中，其他蛋白也發(fā)揮著重要作用，如 Mhp182、Mhp280、Mhp494。在本研究所預測篩選的62個候選蛋白抗原中，有44個是未知功能的推定蛋白，占71%，他們非常保守，又處于和宿主細胞進行物質(zhì)和信號交換的外膜或胞外，他們在Mhp與外界的物質(zhì)、能量和信號交換中可能發(fā)揮不可替代的或極其重要的作用，是疫苗制備中重要的蛋白抗原。

另外，基于這些推定蛋白的關(guān)鍵位置和保守性，也為研究Mhp的致病過程、致病機理和免疫反應機制提供了良好的目標分子。他們的功能需要大量的基礎(chǔ)研究去闡明，研究他們在Mhp的致病中扮演什么樣的角色。因此，本研究也為基礎(chǔ)研究提供了大量的候選蛋白。

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