檸檬醛 肉桂醛 丁香酚抑制耐氟康唑白色念珠菌機理的試驗

王貴強，孫莎莎，范 開，林德貴

（1．中國農業大學動物醫學院，北京 海淀100193；2．北京生泰爾生物科技有限公司，北京 昌平102206）

白色念珠菌是一種人畜共患真菌病，能引起人和動物內臟、皮膚以及黏膜的感染［1］。西藥曾在白色念珠菌病的治療中發揮過舉足輕重的作用，但是，由于抗真菌藥的廣泛應用，真菌對抗真菌藥物尤其是唑類藥物的耐受性逐漸增強，大量耐藥菌株的出現使得白色念珠菌病的治療越來越困難。而且，現有抗真菌藥存在的毒副作用一直未能解決。尋求一種更加安全可靠的途徑來解決真菌感染，已成為醫學界的強烈呼喚。

中藥治病在中國已有幾千年的歷史，我國科學家經過幾十年的探索，發現許多中藥具有抗真菌作用，并分離得到了多種有效化學成分［2］。檸檬醛、肉桂醛、丁香酚具有較強的抗白色念珠菌作用，本試驗將這3種藥物作用于耐藥型白色念珠菌菌株，通過電鏡觀察這3種藥物對白色念珠菌菌體的作用效果，并利用氣相色譜－質譜聯用儀（GC－MS）檢測白色念珠菌細胞膜甾醇合成的變化，來揭示這3種中藥提取物抑制白色念珠菌的機理。

1 材料與方法

1．1 試驗菌株 耐氟康唑白色念珠菌菌株（分離自中國農業大學動物醫院并經培養鑒定）。

1．2 藥物 檸檬醛、肉桂醛、丁香酚，均購自中國藥品生物制品檢定所。

1．3 培養基 RPMI－1640液基，按 NCCLS［3］方案推薦方法配制。

1．4 抗真菌藥物稀釋液制備 將中藥提取物用二甲基亞砜（DMSO）根據不同藥物的溶解度不同進行10倍或50倍溶解稀釋，再用RPMI－1640培養液進行100倍稀釋，使DMSO的終濃度＜1%，經對照試驗該濃度DMSO對白色念珠菌生長無明顯影響。

1．5 掃描電鏡樣品制備 將耐氟康唑白色念珠菌臨床分離株35℃活化24h，分別用64．0mg／L的檸檬醛、16．0mg／L 的肉桂醛和64．0mg／L的丁香酚作用12h；取未經藥物處理的上述菌株孵育12h作為對照組。分別將各組菌體細胞洗滌離心3次，先后經固定、脫水、臨界點干燥、裝臺粘膠及噴金處理后，通過掃描電鏡觀察［4］。

1．6 細胞膜甾醇成分分析－GC／MS檢測（氣相色譜－質譜聯用） 從SDA平板上挑取耐藥型白色念珠菌單克隆菌落接種于1mL RPMI－1640培養基，35℃，200r／min振蕩培養24h后，同樣條件下連續傳代2次，培養16h。分別取菌液1mL于含150 mL RPMI－1640培養液的250mL錐型瓶中，各加入檸檬醛、肉桂醛和丁香酚，使其終濃度分別為50．0mg／L、12．5mg／L、50．0mg／L，空白對照組不加藥。35℃，200r／min振蕩培養，時間不低于48 h，直至獲得足夠的菌量。2 000r／min離心5min，PBS洗滌3次至上清無色，棄上清，室溫風干10 min后，分別稱取不同藥物作用后的白色念珠菌1．0g于50mL無塞玻璃管中，加PBS 5mL和新鮮制備的皂化劑12mL，混勻，80℃水浴皂化60min冷卻至室溫。加石油醚（沸程30℃～60℃）10mL，渦旋混勻1min，提取3次后合并提取液，加水10 mL渦旋混勻洗滌，移去水層。醚層在60℃水浴揮干，得未皂化脂，加環己烷0．9mL混勻后加封保鮮膜放置于4℃冰箱備用。

1．7 GS／MS參數 取上述提取的未皂化脂少量用于GC／MS檢測，具體檢測條件如下：（1）檢測儀器：Finnigan Voyager氣相色譜－質譜聯用儀。（2）色譜柱：VF－5ms石英毛細管柱（30m×0．25mm×0．25 mm）。（3）柱溫：200℃（保持2min）～300℃（保持15min）。（4）升 溫 速 度：20℃／min，汽 化 溫 度250℃。（5）載氣（流量）：He（1．0mL／min），分流比：15∶1，1．0μL樣品。（6）質譜檢測器：EI源，電子能量70Ev，源溫200℃。（7）標準庫：NIST庫2．3細胞膜甾醇成分分析結果

2 結果

2．1 掃描電鏡結果 經過一定處理后，各組白色念珠菌菌體掃描電鏡結果（見圖1）。對照組，白色念珠菌菌體光滑完好，輪廓清晰（A）。檸檬醛組，可見菌體表面出現凹陷，空洞，菌體由橢圓形變得扁平（B）。肉桂醛組，菌體明顯損傷，出現變形、殘缺，甚至出現菌體碎片（C）。丁香酚組菌體未出現明顯變形或損傷，但菌體表面粗糙，附有大量異物（D）。

2．2 細胞膜甾醇成分分析結果 本試驗采用氣相色譜－質譜聯用的方法檢測各種藥物處理后白色念珠菌甾醇成分的變化，初步探討了3種中藥提取物對麥角甾醇生物合成通路上的作用靶點。結果表明，對照組（圖2）以麥角甾醇（b）為主峰，另有兩種細胞膜合成過程中的重要中間產物角鯊烯（a）、羊毛甾醇（c）。經過檸檬醛、肉桂醛、丁香酚處理后的白色念珠菌，麥角甾醇含量與對照組相比，分別變為對照組的9．19%、33．49%、74．36%。同樣，羊毛甾醇的含量也出現了較大變化，檸檬醛組（圖3）峰面積顯著上升，占對照組面積的284．72%，肉桂醛組（圖4）占對照組109．32%，丁香酚組（圖2）占對照組111．69%。同時，檸檬醛組出現了新峰（d、g、f、h），肉桂醛組出現新峰（d、e）。我們由此可以得出結論，檸檬醛阻礙了白色念珠菌細胞膜上羊毛甾醇向麥角甾醇的轉化，導致麥角甾醇合成減少，而麥角甾醇的前體羊毛甾醇在真菌細胞內大量積累，同時產生了大量的其他中間產物，從而發揮抑制耐藥型白色念珠菌的作用。肉桂醛組麥角甾醇的合成明顯減少，同時出現了（d、e）兩個新峰，但羊毛甾醇含量并未見明顯增加。檸檬醛組角鯊烯變為對照組的94．97%，肉桂醛、丁香酚組角鯊烯均沒有出現明顯的藥峰。

3 討論

西藥治療真菌病已有幾十年的歷史，曾經取得過輝煌的成績。白色念珠菌病是最為常見的真菌病之一，然而，現在臨床上出現了越來越多的耐氟康唑、酮康唑的白色念珠菌菌株［5］，使得傳統藥物的治療效果大大降低。中藥具有副作用小、不易產生耐藥性等優點，且經過試驗研究，很多中藥抑菌、殺菌效果明顯。本試驗即證實檸檬醛、肉桂醛對耐氟康唑白色念珠菌具有較好的抑制作用，并揭示了其抑菌機理。

電鏡研究結果顯示，經檸檬醛作用后，耐藥型白色念珠菌表面出現了明顯的凹陷，菌體由原來的橢圓形變得扁平，菌體中間有空洞。而經過肉桂醛作用后，白色念珠菌菌體出現明顯變形，甚至可以見到菌體碎片，這與之前檸檬醛、肉桂醛作用于白色念珠菌的研究基本一致，說明檸檬醛、肉桂醛對耐藥型白色念珠菌同樣具有較好的破壞作用。氣相色譜－質譜檢驗發現，檸檬醛組細胞膜麥角甾醇含量顯著降低，同時羊毛甾醇含量急劇上升。因麥角甾醇是真菌細胞膜的特有成分，麥角甾醇缺乏以及甾醇前體累積會導致真菌細胞膜的破裂［6］，由此我們推測，檸檬醛可能阻斷了白色念珠菌細胞膜上羊毛甾醇到麥角甾醇的合成，使得羊毛甾醇大量積累，麥角甾醇合成顯著減少，導致了白色念珠菌細胞膜的破壞。同時其他藥峰的出現，進一步驗證藥物阻斷了羊毛甾醇到麥角甾醇合成通路，導致中間產物大量積累，具體中間產物成分如何，還需要進一步研究。肉桂醛對白色念珠菌細胞膜甾醇成分亦有較大影響，主要是導致麥角甾醇含量顯著降低，我們由此可以推測，肉桂醛發揮抑菌作用的機制可能是直接與細胞膜上的麥角甾醇發生作用，從而破壞細胞膜穩定性，達到抑制白色念珠菌的目的。

因麥角甾醇是真菌細胞膜的獨特組成成分，而檸檬醛、肉桂醛對其有著非常有效的作用效果，能大量減少麥角甾醇的合成。因此，我們認為，檸檬醛和肉桂醛作為抗真菌藥有很大的研發前景。

［1］ Barnes R A，Denning D W，Evans E G，etal．Fungal infections：a survey of laboratory services for diagnosis and treatment［J］．Commun Dis Rep CDR Rev，1996，6（5）：69－75．

［2］ 夏忠弟，楊軍祥，李沛濤．山蒼子油抗白色念珠菌的機制研究［J］．湖南醫科大學學報，1995，20：107－108．

［3］ National Committee For Clinical Laboratory Standard．Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeast［J］．Tentative standard M 27－T．Pennsylvania：NCCLS，1995，1－22．

［4］ 謝小梅，龍 凱，方建茹，等．肉桂醛、檸檬醛抑制黃曲霉生長機制研究［J］．中國公共衛生，2007，23（3）：301－302．

［5］ Rosenbiatt H M，Byrne W，Arnent M E，etal．Successful treatment of chronic mucocutaneoous candididesis with ketoconazole［J］．J Pediatr，1980，97（4）：657．

［6］ White T C，Marr K A and Bowden R A．Clinical，cellular，and molecular factors that contribute to antifungal drug resistance［J］．Clin Microbiol Rev，1998，11（2）：382－402．